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流式检测细胞周期要点--第1页

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流式检测细胞周期

要点：最关键的就是减少细胞碎片和单细胞悬液的制备！

1、细胞消化要理想，资料显示最好消化时加EDTA，可使流式做的很漂亮；

2、细胞消化后不可吹打过度，减少细胞破碎；以后的吹打也要注意，尤其是固定后的细胞

容易破碎；

3、细胞用PBS洗涤离心，转速不超过1000r/min，有文献用800r/min；可考虑在此过程中

用300目的尼龙网过滤一遍细胞（有人主张用钢网，以减少细胞与尼龙网粘连的损失，本

人认为钢网易损伤细胞，DNA外溢也会造成细胞粘连，所以在细胞数足够的情况下，首选

尼龙网）；

4、离心后的固定，标准做法是将细胞悬液加入预冷70％酒精，而不是向细胞中加酒精，这

样是为了减少细胞聚集，这一点很重要，很多人都忽视了！

5、一般选择4℃固定过夜；

6、加染液前的洗涤仍要注意离心转速的问题；

7、关于PI染液的组成及配方，应主要以文献为主，PI（作用为DNA染色剂）的浓度从

0.5μg/ml,20μg/ml，到50μg/ml都见报道，响应的求助显示都可出良好结果，RNAs酶（由

于PI也可染RNA，故要去除RNA）一般浓度为50μg/ml，配方中的Triton-X-100（曲拉通）

主要是通透细胞膜使PI能进入细胞核。

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8、检测时细胞要达到1～2×10个细胞（实际检测是1万到2万个细胞），为了既保持初始

条件相同，又可搜集到足够的细胞，应选用多孔培养板，在搜集细胞时，浓度大、抑制强的

组可多搜集些孔，以保证检测的细胞数量。如果细胞数量太低，技师为了减少对流式细胞仪

的损伤，就会选择高速流（一般的检测用低速流，误差小），检测的质量就会大大下降，数

据的说服力就下降了！

1.收集细胞；

2.3000～5000rpm离心5min，收集沉淀，重悬于200ul的PBS中，再次离心收集沉淀；

3.75％冰冻乙醇（-20度保存）4度固定过夜or-20度固定1h；

4.离心收集沉淀，PBS洗一次（视沉淀量可忽略）；

5.沉淀重悬于200～500ul的PBS，加入RnaseA37度水浴1h；

6.400目纱布过滤至流式管，加入PI染色，4度避光30min-1h，上机器。

1、Q：要做胃粘膜组织的DNA含量及倍体检查，但取材后要等几个星期才会做流式细胞术检查，请

问：胃组织要怎样保存好呢？用低温保存，还是用乙醇固定？或者固定后再低温下保存？

A：我做过乳腺细胞的DNA含量测定，取得组织以后，先处理成单细胞悬液，然后再加70%冰乙醇

固定，要保证冰乙醇的最终浓度为50%，这样固定的细胞悬液可以至少保存12小时，最多可保存一个月，

上机检测前再加PI综合染液。我就是这样做的，保存了将近三个星期，结果还可以，变异系数为5%.

2、实验中想用PI分析细胞周期及凋亡率，请教几个问题：

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Q：（1）所用的RNAs酶用什么配制呢？用PBS配吗？

A：RNaseA用PBS配制没有问题，但是注意要沸水浴去除DNase的活性。

Q：（2）测细胞周期和凋亡率时都要用RNAs酶，可以一起检测吗？

A：用流式细胞仪测定时细胞周期和凋亡率是同时测定的，不用担心。