DB34T 3308-2018 两系杂交水稻种子纯度检测 分子标记法.docxVIP

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DB34

安徽省地方标准DB34/T3308—2018

两系杂交水稻种子纯度检测分子标记法

Protocolforpuritydetectionoftwo-linehybridseeds-molecularmarkermethod

2018-12-29发布2019-01-29实施

安徽省市场监督管理局发布

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DB34/T3308—2018

前言

本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由安徽省种子质量监督检验站提出。

本标准由安徽省动植物检验检疫标准化委员会归口。

本标准起草单位：安徽省种子质量监督检验站、合肥丰乐种业股份有限公司、安徽省种子管理总站、安徽出入境检验检疫局技术中心。

本标准主要起草人：周桂林、胡晓玲、吴晓亮、曹玉洁、周贤达、张文晓、范家萌、周锐、周红英、宗凯、张奇、徐丽媛、王凤杰、胡娜、王兆贤、刘根、熊成国、王浩波。

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DB34/T3308—2018

两系杂交水稻种子纯度检测分子标记法

1范围

本标准规定了两系杂交水稻种子纯度分子标记检测的原理、实验步骤、结果分析和报告。本标准适用于两系杂交水稻种子纯度鉴定。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T3543.1农作物种子检验规程总则

GB/T3543.2农作物种子检验规程扦样

GB/T3543.5农作物种子检验规程真实性和品种纯度鉴定GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

NY/T1433水稻品种鉴定技术规程SSR标记法

3缩略语

下列缩略语适用于本文件。bp：basepair，碱基对

CTAB：cetyltrimethylammoniumbromide，十六烷基三甲基溴化铵DNA：deoxyribonucleicacid，脱氧核糖核酸

dNTPs：deoxyribonucleosidetriphosphates，脱氧核苷三磷酸

PAGE：polyacrylamidegelelectrophoresis，聚丙烯酰胺凝胶电泳PCR：polymerasechainreaction，聚合酶链式反应

SSR：simplesequencerepeat，简单序列重复

Taq酶：Taq-DNApolymerase，耐热DNA聚合酶ddH2O：双蒸水（超纯水）

4原理

我国生产上两系水稻的不育基因主要为温敏核不育基因tms5，其次为光敏核不育基因pms1、pms3，根据其对应的特征标记在品种中的等位基因型，可判断该品种是否为两系杂交水稻或不育系。同时，水稻的不同品种，其基因组存在着能够世代稳定遗传的重复次数不同的简单重复序列(SSR)，且SSR标记具有共显性，杂交种子具有双亲等位标记互补带型，针对不同品种筛选其区别于其它品种的特征SSR标记，通过SSR多态性分析，可判断受检种子是否为杂交种并区别正常个体与异品种个体。本标准综合利用两系不育基因特征标记和不同品种特征SSR标记，鉴定一定数量送验样品中的正常个体数目或百分率，从而对整体样品的一致程度作出评价。

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DB34/T3308—2018

5仪器设备

高压灭菌锅、超纯水仪、高速离心机、恒温水浴锅（30℃~100℃)、核酸蛋白测定仪、组织研磨仪、PCR扩增仪、高压电泳仪、垂直电泳槽及制胶附件、微量可调加样器（2μL、10μL、100μL、1000μL）。

6试剂和溶液配制

所用试剂均为分析纯，试剂配制用水应符合GB/T6682规定的一级水的要求。6.1试剂

6.1.1DNA提取

十六烷基三甲基溴化铵、三氯甲烷、异戊醇、异丙醇、乙二胺四乙酸二钠、三羟甲基氨基甲烷、盐酸、氢氧化钠、氯化钠。

6.1.2PCR扩增

引物、DNA、dNTPs、Taq酶、10×Buffer缓冲液、ddH2O、和Mg2+或者Mix反应混合液。6.1.3PAGE电泳

去离子甲酰胺、溴酚蓝、二甲苯青FF、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、硼酸、尿素、亲和硅烷、剥离硅烷、DNA分子量标准、无水乙醇、四甲基乙二胺、过硫酸铵、冰醋酸、硝酸银、甲醛、氢氧化钠。

6.2溶液配制见附录A。

7实验步骤

7.1取样

从送检样品中分取规定数量的试样，试样采用单个个体