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感受态细胞--第1页
感受态细胞
1感受态细胞:
细菌处于0℃,CaCl2的低渗溶液中,菌细胞膨胀成球形,转化混
合物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面,
经42℃短时间热冲击处理,促使细胞吸收DNA复合物。
钙离子的作用是结合于细胞膜上,是细胞膜呈现一种液晶态。在
冷热变化刺激下液晶态的细胞膜表面会产生裂隙,使外源DNA进入。
所谓的感受态,即指受体(或者宿主)最易接受外源DNA片段并
实现其转化的一种生理状态,它是由受体菌的遗传性状所决定的,同
时也受菌龄、外界环境因子的影响。将快速生长中的大肠杆菌(对数
生长期)置于经低温预处理的低渗氯化钙溶液中,便会造成细胞膨胀
(形成原生质球),使细菌处于容易吸收外源DNA的状态。感受态细
胞):受体细胞经过一些特殊方法(如:CaCl,RuCl等化学试剂法)的
处理后,细胞膜的通透性发生变化,成为能容许多有外源DNA的载体
分子通过的感受态细胞。
2分子克隆中重组体筛选和鉴定的原理方法:
重组克隆的初步筛选
克隆的筛选可以根据载体类型、受体细胞特性的变化、外源DNA
分子本身的特性,采用不同的方法。主要有遗传学检测、物理特性检
测、分子杂交以及免疫学分析等。从初步筛选直到分子杂交,进一步
到DNA测序和基于蛋白质功能的分析,使得对克隆的检测逐步深入、
精确。
感受态细胞--第1页
感受态细胞--第2页
.1重组克隆的遗传学检测
遗传学检测方法是重组子筛选过程中最初的检测步骤。重组子的
表征来源于载体所携带的标记和重组子结构特性。根据这两类表征对
重组子进行初步筛选。
(1)抗药性筛选
这是利用载体DNA上组装的抗药性选择标记进行筛选的方法。
常用的抗生素筛选剂:氨苄青霉素(ampicillin,Ap或Amp);氯
霉素(chloramphenicol,Cm或Cmp);卡那霉素(kanamycin,
Kn或Kan);四环素(tetracymic,Tc或Tet);链霉素(2)插入失
活筛选法
检测克隆载体携带有外源DNA的通常方法是插入失活。经过抗药
性筛选获得的大量转化子中既包含所需要的重组子,也包含非重组子。
为了进一步筛选出重组子,可利用质粒载体的抗药性进行再次筛选。
(3)插入表达筛选法
与插入失活相反,插入表达法是外源目的基因插入特定载体后,
能激活用于筛选操作的标记基因的表达,由此进行转化子的筛选。设
计载体时,在筛选标记基因前面连接一段具有抑制
作用的负调控序列,插入外源DNA将使该负调控序列失活,其下
游的筛选标记基因才能表达。
(4)环丝氨酸筛选
这种筛选方法只使用于抗四环素的基因插入失活的重组克隆筛选。
(5)显色反应筛选法
上面所述的抗药性等筛选法是用插入失活原理筛选重组DNA的方
法。对菌落或噬菌斑平板进行影印复制,通过两个平板的比较,才能
辨别插入失活的表型特征。这给筛选工作带来许多麻烦。
显色反应可以在平板上或膜上直接显示出重组克隆,不仅方便而
且灵敏
2.报告基因
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