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感受态细胞

1感受态细胞：

细菌处于0℃，CaCl2的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混

合物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，

经42℃短时间热冲击处理，促使细胞吸收DNA复合物。

钙离子的作用是结合于细胞膜上，是细胞膜呈现一种液晶态。在

冷热变化刺激下液晶态的细胞膜表面会产生裂隙，使外源DNA进入。

所谓的感受态，即指受体（或者宿主）最易接受外源DNA片段并

实现其转化的一种生理状态，它是由受体菌的遗传性状所决定的，同

时也受菌龄、外界环境因子的影响。将快速生长中的大肠杆菌（对数

生长期）置于经低温预处理的低渗氯化钙溶液中，便会造成细胞膨胀

（形成原生质球），使细菌处于容易吸收外源DNA的状态。感受态细

胞):受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl，RuCl等化学试剂法）的

处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许多有外源DNA的载体

分子通过的感受态细胞。

2分子克隆中重组体筛选和鉴定的原理方法：

重组克隆的初步筛选

克隆的筛选可以根据载体类型、受体细胞特性的变化、外源DNA

分子本身的特性，采用不同的方法。主要有遗传学检测、物理特性检

测、分子杂交以及免疫学分析等。从初步筛选直到分子杂交，进一步

到DNA测序和基于蛋白质功能的分析，使得对克隆的检测逐步深入、

精确。

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.1重组克隆的遗传学检测

遗传学检测方法是重组子筛选过程中最初的检测步骤。重组子的

表征来源于载体所携带的标记和重组子结构特性。根据这两类表征对

重组子进行初步筛选。

(1)抗药性筛选

这是利用载体DNA上组装的抗药性选择标记进行筛选的方法。

常用的抗生素筛选剂:氨苄青霉素（ampicillin，Ap或Amp）；氯

霉素（chloramphenicol，Cm或Cmp）；卡那霉素（kanamycin，

Kn或Kan）；四环素（tetracymic，Tc或Tet）；链霉素（2）插入失

活筛选法

检测克隆载体携带有外源DNA的通常方法是插入失活。经过抗药

性筛选获得的大量转化子中既包含所需要的重组子，也包含非重组子。

为了进一步筛选出重组子，可利用质粒载体的抗药性进行再次筛选。

（3）插入表达筛选法

与插入失活相反，插入表达法是外源目的基因插入特定载体后，

能激活用于筛选操作的标记基因的表达，由此进行转化子的筛选。设

计载体时，在筛选标记基因前面连接一段具有抑制

作用的负调控序列，插入外源DNA将使该负调控序列失活，其下

游的筛选标记基因才能表达。

（4）环丝氨酸筛选

这种筛选方法只使用于抗四环素的基因插入失活的重组克隆筛选。

（5）显色反应筛选法

上面所述的抗药性等筛选法是用插入失活原理筛选重组DNA的方

法。对菌落或噬菌斑平板进行影印复制，通过两个平板的比较，才能

辨别插入失活的表型特征。这给筛选工作带来许多麻烦。

显色反应可以在平板上或膜上直接显示出重组克隆，不仅方便而

且灵敏

2.报告基因