DB46T 644-2024咖啡果小蠹快速分子鉴定技术规程.docx

ICS65.020．99CCSB16

46

海南省地方标准

DB46/T644—2024

咖啡果小蠹分子鉴定技术规程

Technicalcodeformolecularidentificationofcoffeeberryborer

2024-09-23发布2024-11-01实施

海南省市场监督管理局发布

I

DB46/T644—2024

目次

前言 III

引言 IV

1范围 1

2规范性引用文件 1

3术语与定义 1

4缩略语 1

5咖啡果小蠹基本信息 1

6原理 1

7主要仪器设备和主要试剂 1

7.1主要仪器设备 1

7.2试剂 2

8分子鉴定操作步骤 2

8.1样品处理 2

8.2DNA提取 2

8.3DNA纯度和浓度测定 2

8.4特异性引物使用 2

8.5PCR扩增反应 2

8.6电泳及测序 2

9结果判定 2

10样品保存、复核与记录 2

10.1样品保存 2

10.2复核 2

10.3记录 2

附录A（资料性）咖啡果小蠹基本信息 3

A.1生物学特性 3

A.2传播途径 3

A.3地理分布 3

A.4寄主 4

附录B（规范性）DNA提取方法及PCR检测方法 5

B.1DNA提取方法 5

B.2引物序列 5

B.3扩增反应体系 5

B.4扩增反应条件 5

II

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B.5PCR扩增片段电泳结果 5

B.6PCR扩增片段测序结果 6

B.7结果判定 6

III

DB46/T644—2024

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的

规定起草。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由海南省农业农村厅提出并归口。

本文件起草单位：中国热带农业科学院香料饮料研究所。

本文件主要起草人：孟倩倩、王政、孙世伟、高圣风、苟亚峰、刘世超、田甜、温思为、薛超。

IV

DB46/T644—2024

引言

2019年5月，首次在海南省万宁市兴隆地区咖啡种植园中发现咖啡果小蠹入侵，标本经鉴定确定为咖啡果小蠹，于2019年6月上报农业农村部。海南地区作为罗布斯塔咖啡主要产区，目前在海南万宁、琼中、琼海等地均发现咖啡果小蠹为害。

依据外部形态学特征对咖啡果小蠹的鉴定，需要昆虫分类专业人员和显微设备才能鉴别，特别是对于卵、幼虫、蛹及特征脱落的残体等样本，存在鉴别难度大、耗时长等问题。

鉴于以上原因，特制定本文件，可显著提高咖啡果小蠹检测效率，为咖啡果小蠹的口岸检疫、监测防控提供必要的技术支撑。

1

DB46/T644—2024

咖啡果小蠹分子鉴定技术规程

1范围

本文件规定了咖啡果小蠹的缩略语、基本信息、原理、仪器和试剂、分子鉴定操作步骤、结果判定、样品保存、复核与记录。

本文件适用于植物及其产品中携带咖啡果小蠹的检疫和鉴定。

2规范性引用文件

本文件没有规范性引用文件。

3术语与定义

本文件没有需要界定的术语和定义。

4缩略语

下列缩略语适用于本文件。

DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonuleicacid）mtDNACOI：线粒体DNA细胞色素C氧化酶亚基I

PCR：聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction）ddH2O：双蒸水（doubledistilledH2O）

5咖啡果小蠹基本信息

咖啡果小蠹基本信息见附录A。

6原理

不同物种间mtDNACOI序列存在片段差异，可根据种间序列的差异性设计特异性引物，通过PCR扩增，获得对应特异性片段，用于区分不同物种。根据咖啡果小蠹mtDNACOI特征，采用所设计特异性引物对疑似样品进行PCR扩增，利用分子手段对咖啡果小蠹进行鉴定。

7主要仪器设备和主要试剂

7.1主要仪器设备

研钵、水浴锅、纯水仪、漩涡振荡器、离心机、多功能酶标仪、冷冻冰箱、PCR仪、凝胶成像仪、微量移液器（0.1μL～2.5μL、1μ