酶学与酶工程.ppt

2超过滤在加压情况下，将待浓缩溶液通过一层只容许水分子和小分子选择性地透过的微孔超滤膜,而酶等大分子被滞留,从而达到浓缩目的的一种有效方法。优点：没有热破坏，没有相变化，保持原来的离子强度和pH。只要膜选择适当,浓缩过程还可能同时进行粗分,此外成本也不高,已渐渐为人们所采用。超过滤可用于小量样品,也可用于工业生产规模。注意：超滤膜有干型和湿型两种，后者必须保持于溶液中。第31页,共38页，星期六，2024年，5月3胶过滤这是利用葡聚糖凝胶sephdexG—25或G—50等能吸水膨润、而酶等大分子被排阻于胶外的原理进行的浓缩。通常采用“静态”方式，即将干胶直接加入样品溶液（干胶用量可根据胶的吸水量计算），胶吸水膨润一定时间后，再借助过滤或离心等办法分离浓缩的酶液。胶过滤浓缩法的优点是，条件温和，操作简便，也没有pH与离子强度等的改变。第32页,共38页，星期六，2024年，5月4冰冻浓缩原理:溶液相对纯水融点升高,冰点降低。这有两种方式：1.先将溶液冻成冰块。然后使之缓缓融解，这样几乎不含蛋白质和酶的冰块就浮于液面,而酶等则融解并集中于下层溶液(约为原体积的1／4);2.让酶溶液缓缓冻凝，尔后移去水形成的冰块.问题:浓缩过程可能会发生离子强度与pH的变化,从而导致酶失效；其次是需要大功率的致冷设备.第33页,共38页，星期六，2024年，5月5.其它还有聚乙二醇等浓缩法，它们一般只适用小量样品，而且往往成本很高。第34页,共38页，星期六，2024年，5月（三）酶的纯化在抽提液中,除了待纯化的酶外,通常不可避免地杂有其它小分子和大分子物质.其中小分子杂质在以后的纯化步骤中一般会自然地除去,因此比较容易解决;大分子物质包括核酸,粘多糖和其它蛋白质.核酸和粘多糖往往干扰以后的纯化,特别是细菌等的抽提液中常会有大量核酸,最好设法预先除去.核酸可加硫酸链霉素,聚乙烯亚胺,色精蛋白或MnCl2等使之沉淀移去,必要时也可使用核酸酶.粘多糖则常用醋酸铅,乙醇,丹宁酸和离子型表面活性剂等处理解决,有时也可用酶。这些杂质移除后,余下的是杂蛋白.纯化的主要工作,同时也是比较困难的工作,就是要将酶从杂蛋白中分离出来.第35页,共38页，星期六，2024年，5月1、纯化方法的选择为了获得理想的分离效果应注意：第一，工作前应对所要纯化的酶的理化性质(溶解度、分子大小和解离特性)以及酶的稳定性等有一个较全面的了解，这样就可知道应选择哪些办法与条件，避免哪些处理，以及了解在什么情况下酶比杂蛋白更稳定而能加以利用。第36页,共38页，星期六，2024年，5月第二，判断选择的方法与条件是否适当，始终应以活力测定为准则。一个好的步骤应该是比活力(纯度)提高多，总活力回收高（回收率高），而且重现性好。一般地说，纯化过程不宜重复相同的步骤和方法，因为这样只能使酶的总活力下降，而不能使酶的纯度进一步上升。第三，要严格控制操作条件，特别是随着酶逐渐纯净、杂蛋白逐渐移除、总的蛋白浓度下降，蛋白质间的相互保护作用随之减小，酶的稳定性亦越小，就更应注意防止变性。第37页,共38页，星期六，2024年，5月感谢大家观看第38页,共38页，星期六，2024年，5月退出关于酶学与酶工程第一章酶学与酶工程第六节影响酶活力的因素第七节酶的分离纯化第2页,共38页，星期六，2024年，5月第六节影响酶活力的因素一、酶活力的测定酶活力（enzymeactivity）也称为酶活性，是指酶催化一定化学反应的能力。1.酶活力与酶反应速度酶活力的大小可以用一定条件下所催化的某一化学反应的反应速度（reactionvelocity）来表示，两者呈线性关系。酶反应速度可用单位时间内底物的减少量或产物的增加量来表示。第3页,共38页，星期六，2024年，5月Time第4页,共38页，星期六，2024年，5月2.酶的活力单位（U，activityunit）酶活力的大小及酶含量的多少，用酶活力单位表示，即酶单位（U）。酶单位的定义是：在一定条件下，一定时间内将一定量的底物转化为产物所需要的酶量。这样酶的含量就可以用每克酶制剂或每毫升酶制剂含有多少酶单位来表示（U/g或U/ml）。1961年国际酶学委员会规定“国际单位”表示酶活力；一个国际单位（IU）是指在最适反应条件下，1每分钟催化1μmoL底物转化为产物所需要的酶量。1972年又推荐一种新的酶活力单位——Katal（简称K