冰冻切片免疫荧光染色及HE染色流程.pdf

冰冻切片免疫荧光染色流程(表面分子，以CD4为例)

（1）冰冻切片室温晾干15分钟；

（2）用组化油笔将待染组织圈好，置PBS中浸泡10分钟，以去除OCT；

（3）用含10％正常山羊血清的PBS室温封闭切片1小时（此步可以不洗涤，把

封闭液吸干即可）；

（4）加入CD4单抗(1:100;SeroTec,Inc,Raleigh,NC,USA)，4℃孵育过夜；

（5）PBS洗3次，每次10分钟；

（6）加入罗丹明标记的羊抗小鼠的IgG二抗(1:50;Sigma公司)，37℃孵育1

小时；

（7）PBS洗3次，每次15分钟；

（8）封片后，荧光显微镜观察结果并拍照；

（9）在每切片中随机选择5个视野计数阳性细胞数。

`

注意事项：（1）整个实验过程中勿使表面干燥

（2）稀释、加二抗（荧光抗体）及此后的洗涤过程中注意避光附注1：如

目的分子为胞内分子，各种液体中需要加透膜剂0.3%TrixtonX100。

附注2：所用液体（表面分子染色不用0.3%TrixtonX100）：

（1）pH7.40.01MPBS：

配方为：0.1MPBS100ml+ddH2O900ml+NaCl7.65g

0.1MPBS配方为：Na2HPO423g+NaH2PO4﹒2H2O

5.9g+NaCl17g定容至2000ml,高压，pH7.2-7.4

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（2）洗涤液：0.3%TrixtonX100－pH7.40.01MPBS，分装15ml/支－20℃保

存

（3）封闭液：10％NGS－0.3%TrixtonX100－pH7.40.01MPBS，分装1.2ml/

支－20℃保存

（4）抗体稀释液：1％BSA－0.3%TrixtonX100－pH7.40.01MPBS，分装

1ml/支－20℃保存

一、操作方法及步骤：

①取材，未能固定的组织取材，不能太大太厚，厚者冰冻费时，大者难以

切完整，最好为24×24×2mm。

②取出组织支承器，放平摆好组织，周边滴上包埋剂，速放于冷冻台上，

冰冻。小组织的应先取一支承器，滴上包埋剂让其冷冻，形成一个小台后，再

放上细小组织，滴上包埋剂。

③将冷冻好的组织块，夹紧于切片机持承器上，启动粗进退键，转动旋

钮，将组织修平。

④调好欲切的厚度，根据不同的组织而定，原则上是细胞密集的薄切，纤

维多细胞稀的可稍为厚切，一般在5～10um间。

二、冰冻切片时的注意事项：

①防卷板及切片刀和持刀架上的板块应保持干净，需经常用毛笔挑除切片

残余和用柔软的纸张擦。有时需要每切完一张切片后就用纸擦一次。因为这个

地方是切片通过和附贴的地方，如果有残余的包埋剂粘于刀或板上，将会破坏

甚至撕裂切片，便切片不能完整切出。

②多例多块组织同时需做冰冻切片时，可各自放于不同的支承器上，于冷

冻台上冻起来，然后依据不同的编号，依序切片，这样做既不费时也不会乱。

③放置组织冰冻前，应视组织的形状及走势来放置，所谓“砍柴看柴势”，

切片也是如此，如果胡乱放置，就不能收到很好的效果。

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④组织块不须经各种固定液固定，尤其是含水的固定液，在未达到固定

前，更不能使用(??不用固定吗？--weibin)。临床快速冰冻切片，不须要预先固

定，一是为了争取时间，二是固定了的组织，反而增加了切片的难度。如果使

用未完全固定的组织做冰冻切片，就会出现冰晶。这是因为含水的固定液在组

织未经固定前，其中的水份也可渗入到组织中去，当冰冻发生时，这些水份就

存留于组织中，形成了冰晶。

⑤当切片时，如果发现冰冻过度时，可将冰冻的组织连同支承器取出来，

在室温停留片刻，再行切片，或者用口中哈气，或者用大拇指按压组织块，以

此来软化组织，再行切片。另者，调高冰冻点。

⑥用于附贴切片的载玻片，不能存放于冷冻处，于室温存放即可。因为当

附贴