细胞生物学细胞分离实验.pdfVIP

级细

分胞

离核

与

线

粒

体

的

分

课程名称：细胞生物学

专业名称：生物工程

姓名：

学号：

指导老师：

实验设计方案

实验项目细胞核与线粒体的分级分离

课程名称细胞生物学实验技术指导教师

年级班级专业生物工程

小组成员

开课学期2011-2012第一学期

一、实验目的

1.了解细胞核与线粒体分离的基本原理及掌握操作方法。

2.掌握匀浆和差速离心分级分离细胞组分的原理及过程，学习分级分离细胞

组分的方法。

二、实验原理

细胞组分的分级分离是研究亚细胞组分的化学组成、理化特性及其功能

的基本方法。离心是利用旋转运动的离心力以及物质的沉降系数或浮力密度

的差异进行分离、浓缩和提纯的一种方法。用组织匀浆的方法在悬浮介质中

进行差速离心制备线粒体，颗粒的沉降速度取决于离心机的转速和它的浮力

密度、半径及悬浮介质的黏度。在一均匀悬浮介质中离心一段时间后，组织

匀浆中的各种细胞器及其它内含物由于沉降速度不同而停留在高低不同的位

置。依次增加离心力和离心时间，就能够使这些颗粒按其大小、轻重分批沉

降在离心管底部，从而分批收集。细胞器中最先沉淀的是细胞核，其次是线

粒体，其它更轻的细胞器和大分子可依次再分离。悬浮介质通常用缓冲的蔗

糖溶液，它属于等渗溶液，比较接近细胞质的分散相，在一定程度上能保持

细胞器结构和酶的活性，有利于分离，此外，该方法中采用的氯化钙有稳定

核膜的作用。整个操作应注意使样品保持4℃，避免酶失活。线粒体的鉴定

用詹纳斯绿B（JanusgreenB）活性染色法。

细胞组分的分离流程：组织匀浆分级离心分析

三、实验器材

1.

仪器：

高速冰冻离心机、显微镜、天平、玻璃匀浆器、解剖刀剪、烧杯、量

筒、离心管、高速离心管、玻璃漏斗、尼龙布、载玻片、盖玻片

2.材料：

大白鼠

3.试剂：

0.9%生理盐水、0.25mol/L蔗糖、0.3mmol/LCaCl匀浆液、1%甲苯胺蓝溶

2

液、0.02%詹纳绿B染液

四、实验步骤

一、细胞核的分离提取

1．实验前大鼠空腹12小时，用颈椎脱臼法处死小白鼠，迅速剖腹取肝，在

冰浴的小烧杯中剪成小块（去除结缔组织），尽快置于冰冷的生理盐水中，反

复洗涤，尽量除去血液，用滤纸吸去表面的液体。

2．剪碎的肝组织移入玻璃匀浆管中，加入适量匀浆液，进行匀浆（注意保持

冰浴状态），快速匀浆20～30次后，用蔗糖／氯化钙预湿的尼龙布过滤于离

心管中。

3．将装有滤液的离心管以2500g，4℃离心15min，取上清液，移入高速离

心管中，并保存于冰浴中，待分离线粒体用。

4．收集的沉淀以少量蔗糖／氯化钙溶液重新悬浮，以2500g离心15min，

弃上清。

5．洗涤过的沉淀以少量溶液重新悬浮，制备成细胞核悬液，滴一滴于干净的