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免疫组化染色质量控制标准作业指导书

免疫细胞学是免疫学与细胞化学相结合的一个分支学科，它是

在免疫学理论基础上利用抗原与抗体的特异性反应，在细胞或组织

中定位抗原或抗体。免疫组化技术是用标记物或显色物标记的抗体

检测细胞和组织内的抗原，从而达到诊断和研究疾病的目的。随着

免疫组织化学技术在临床病理研究与诊断中的广泛应用，因其反应

步骤多，影响因素复杂，质量控制已被越来越多的病理技术专家重

视。20xx年全国病理学技术进展和应用研讨会上提出将质控应用到

免疫组化技术上。本文对免疫组化技术的标准化质控进行了探索，

现介绍如下。

1、标本的固定

为了更好地保持细胞和组织原有的形态结构，防止组织自溶，

必须对标本进行固定。标本固定的好坏是影响病理诊断的关键，同

样也影响免疫组化的结果，所以固定是质控的首要也是关键步骤。

影响标本固定主要因素有以下几点。①标本离体后固定不及时：一

般离体标本要求15min内必须固定，最好是在手术室由专业的护士

将离体的标本用清水冲洗干净后立即放入质量浓度40g/L中性甲醛

内，固定液的用量为标本体积的5～10倍。而目前本院手术室做不

到这一点，这就要求病理技术员在接到标本后要及时固定，不能延

误时间。但是在手术室和路上延误的时间不能控制。因此，呼吁临

床医生应和病理科联合起来，将标本固定地点放在手术室，以使标

本及时固定，减少因固定不及时而出现的诊断困难。②标本固定的

时间：40g/L中性甲醛渗透速度一般是2mm/h，随着时间延长速度会

逐渐减慢，增加浓度反而会降低渗透速度。一般手术标本用40g/L

中性甲醛固定的时间以12～24h为佳，最长不要超过72h；如穿刺

标本可用AFF液固定2～4h。有研究显示，用40g/L中性甲醛固定1

周后的标本，其组织抗原几乎不能被检出[1]。但是，日常工作中常

常会遇到有人催发病理报告的情况，他们希望病理科的报告最好像

检验科那样早晨送下午就能拿到。这种情况下只有缩短制片程序，

包括固定时间，这种操作只会增加病理诊断的风险，埋下误诊的隐

患。③固定液的种类及浓度不恰当：免疫组化检测常用的固定液有

40g/L中性甲醛、40g/L钙?甲醛、40g/L多聚甲醛磷酸缓冲液等。

穿刺标本可用AFF液固定。固定液浓度过高、过低都会因组织固定

差而导致组织抗原丢失或易出现非特异性背景染色，从而影响免疫

组化结果。EDTA是用于骨组织脱钙的螯合剂，因在脱钙过程中对组

织的破坏性小而得到广泛使用，缺点是脱钙时间太长。④标本固定

时处理不当：如淋巴结组织往往因包膜没切开，影响了固定液的渗

透，而使组织固定差。大标本因没切开固定，而使标本固定不匀

等，都可影响免疫组化染色。我们接诊了很多低级别医院来会诊标

本，都存在以上问题，因固定差而直接影响免疫组化结果及诊断。

2、切片与烤片

免疫组化检测的切片厚以3～4μm为宜，淋巴结组织可行2μm

厚切片，太厚影响染色结果和诊断。因免疫组化反应步骤多，易出

现脱片现象，需要将载玻片处理后方可使用。处理方法：先将载玻

片用肥皂水洗净后，放入清洁液中浸泡12～24h，清水冲洗2h，蒸

馏水洗5遍，体积分数0.95乙醇浸泡后，用干净的绸布擦干，再挂

胶。挂胶方法有很多种，如：APES、铬矾明胶液、多聚赖氨酸等。

切片裱片要完整，不能有气泡，烤片时温度不能过高，65℃烤

30min即可进行染色。烤片时间过短易造成脱片，温度过高或过长

可破坏抗原。

3、减少或消除非特异性染色

组织中非抗原抗体反应出现的阳性染色称为非特异性背景染

色。最常见的原因是蛋白吸附于高电荷的胶原和结缔组织成分上。

常见的消除方法有：①在滴加第一抗体前用体积分数0.02～0.05山

羊血清或牛血清封闭组织上带电荷基团，而除去与第一抗体的非特

异性结合。此种方法一般用于不需抗原修复的抗体或内源性生物素

较高的组织效果佳。②体积分数0.03～0.06过氧化氢法是目前最常

用的方法之一，我们认为体积分数0.05过氧化氢处理10～15min的

效果较好。③洗涤过程中用高盐缓冲液冲洗切片，也是消除非特异

性染色的方法之一。方法是将磷酸缓冲液中加入10g/L的氯化钠

（pH7.4）。④稀释抗体浓度，但必须通过阳性对照来掌握稀释的最

佳浓度。我们的