医学课件 G基因操作.ppt

DNA克隆概述质粒DNA的制备质粒的酶切和电泳重组DNA-连接、转化、鉴定DNA克隆的应用DNA测序（推测蛋白质序列）基因启动子和调控序列的分离和分析蛋白质/酶/RNA功能的研究基因突变（与疾病相关）获得大量有价值的蛋白质和分子转基因动植物、基因治疗改变蛋白性质宿主细菌E.coli酵母S.Cerevisiae载体克隆载体表达载体（真核、原核）质粒（plasmid）（松弛型和严谨型）噬菌体（M13、phageλ）粘粒cosmid人工染色体YAC/BAC病毒virus复习题1.DNA克隆的基本原理是什么？2.什么是基因组文库、cDNA文库？3.如何将目的DNA从一种载体转移到另一种载体？4.碱裂解法小量制备质粒的原理和过程？5.琼脂糖凝胶电泳的原理和过程？6.什么是感受态细胞？怎样进行重组DNA的转化？7.单酶切和双酶切对DNA克隆有什么不同的影响？8.基因工程常用的酶有哪些？各有什么功能？9.蓝白斑筛选的原理是什么？*Genemanipulation基因操作载体DNA（vector）目的DNA（targetfragment）重组DNA（recombinantDNA）宿主（host）扩增（amplification）克隆（clone）DNA克隆-概述pUC183kblacZ/oriamprMCS复制起始位点合适的酶切位点-多克隆位点标记基因maker/reportergene4.选择基因selectgene启动子promoter增强子enhancer亚克隆（subcloning）1.定义将克隆DNA片段从一个载体转移到另一个载体2.应用研究克隆DNA片段其中的一段序列克隆DNA片段的表达3.操作过程重组DNA的分离酶切（限制性内切酶）DNA片段的分离和纯化连接（新载体）筛选新重组DNA的分析1.重组DNA的分离重组DNA原载体DNA目的DNA3.将目的DNA连接到新载体，转化，筛选并鉴定2.对新载体和目的DNA酶切、分离和纯化DNA文库（DNAlibraries）克隆DNA片段基因组DNA片段cDNADNA文库（基因组文库、cDNA文库）：将整套基因组DNA（cDNA）连接到克隆载体上构建的分子克隆的总和。质粒DNA制备——少量制备（miniprep）碱裂解法（alkalinelysis）原理：根据环状质粒DNA与线形染色体DNA的拓扑学差异pH值=12.0~12.5：染色体DNA变性双链解开，质粒DNA的双链仍紧密结合pH值=中性（加入pH4.8的乙酸钾）质粒DNA准确复性，染色体DNA缠绕成网状结构，通过离心与变性蛋白质一起沉淀，被除去。菌细胞1.悬浮细胞2.溶菌酶处理3.SDS/NaOH4.醋酸钾中和培养液离心质粒、RNA、蛋白质(部分)蛋白质、细菌染色体DNA、膜接种、过夜培养（3-5mL）水相（质粒、RNA）变性蛋白质苯酚-氯仿水相RnaseA二倍体积乙醇质粒DNATE溶解基因克隆的工具酶限制性内切酶其他几种工具酶S1核酸酶（水解单链DNA，粘性末端变为平头末端）碱性磷酸酶（去除DNA末端的磷酸根）逆转录酶（mRNAcDNA）末端转移酶（3’端+polyA或polyC，平头末端变为粘性末端）DNA连接酶质粒的酶切和电泳限制性内切酶（restrictionendonuclease） 细菌的限