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DNA提取过程中各种试剂的作用及原理

1．溶液I—溶菌液：

溶菌酶：它是糖苷水解酶，能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的β-1,4

糖苷键，因而具有溶菌的作用。当溶液中pH小于8时，溶菌酶作用受到抑制。

葡萄糖：增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械剪切力作用而降解。

EDTA：（1）螯合Mg2＋、Ca2＋等金属离子，抑制脱氧核糖核酸酶对DNA的降解

作用（DNase作用时需要一定的金属离子作辅基）;（2）EDTA的存在，有利于

溶菌酶的作用，因为溶菌酶的反应要求有较低的离子强度的环境。

2．溶液II－NaOH－SDS液：

NaOH：核酸在pH大于5，小于9的溶液中，是稳定的。

氢键的解离

但当pH＞12或pH＜3时，就会引起双链之间而变性。

在溶液II中的NaOH浓度为0.2mo1／L，加抽提液时，该系统的pH就高达12.6，

因而促使染色体DNA与质粒DNA的变性。

SDS：SDS是离子型表面活性剂。它主要功能有：

（1）溶解细胞膜上的脂质与蛋白，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜。

（2）解聚细胞中的核蛋白。

（3）SDS能与蛋白质结合成为R-O-SO3-…R＋-蛋白质的复合物，使蛋白质变性

而沉淀下来。

但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取过程中，必须把它去除

干净，防止在下一步操作中

（用RNase去除RNA时）受到干扰。

3.溶液III--3mol／LNaAc（pH4.8）溶液：NaAc的水溶液呈碱性，为了调节

pH至4.8，必须加入大量的冰醋酸。

所以该溶液实际上是NaAc-HAc的缓冲液。用pH4.8的NaAc溶液是为了把pH12.6

的抽提液，调回pH至中性，

使变性的质粒DNA能够复性，并能稳定存在。而高盐的3mol／LNaAc有利于变

性的大分子染色体DNA、

RNA以及SDS-蛋白复合物凝聚而沉淀之。前者是因为中和核酸上的电荷，减少

相斥力而互相聚合，

后者是因为钠盐与SDS－蛋白复合物作用后，能形成较小的钠盐形式复合物，使

沉淀更完全。

4．为什么用无水乙醇沉淀DNA？

用无水乙醇沉淀DNA，这是实验中最常用的沉淀DNA的方法。乙醇的优点是可以

任意比和水相混溶，

乙醇与核酸不会起任何化学反应，对DNA很安全，因此是理想的沉淀剂。

DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去DNA周围的水

分子，使DNA失水而易于聚合。一般实验中，是加2倍体积的无水乙醇与DNA

相混合，其乙醇的最终含量占67％左右。

因而也可改用95％乙醇来替代无水乙醇（因为无水乙醇的价格远远比95％乙醇

昂贵）。

但是加95％的乙醇使总体积增大，而DNA在溶液中有一定程度的溶解，因而DNA

损失也增大，

尤其用多次乙醇沉淀时，就会影响收得率。折中的做法是初次沉淀DNA时可用

95％乙醇代替无水乙酵，

最后的沉淀步骤要使用无水乙醇。也可以用0.6倍体积的异丙醇选择性沉淀DNA。

一般在室温下放置15－30分钟即可。

5．在用乙醇沉淀DNA时，为什么一定要加NaAc或NaCl至最终浓度达0.1～

0.25mol/L？

在pH为8左右的溶液中，DNA分子是带负电荷的，加一定浓度的NaAc或NaCl，

使Na+中和DNA分子上的负电荷，

减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA钠盐沉淀，当

加入的盐溶液浓度太低时，

只有部分DNA形成DNA钠盐而聚合，这样就造成DNA沉淀不完全，当加入的盐

溶液浓度太高时，

其效果也不好。在沉淀的DNA中，由于过多的盐杂质存在，影响DNA的酶切等

反应，

必须要进行洗涤或重沉淀。

6．加核糖核酸酶降解核糖核酸后，为什么再要用SDS与KAc来处理？

加进去的RNase本身是一种蛋白质，为了纯化DNA，又必须去除之，加SDS可使

它们成为SDS-蛋白复合物沉淀，再加KAc使这些复合物转变为溶解度更小的钾

盐形式的SDS-蛋白质复合物，使沉淀更加完全。也可用饱和酚、氯仿抽提再沉

淀，去除RNase。在溶液中，有人以KAc代替NaAc，也可以收到较好效果。

7．为什么在保存或抽提DNA过程中，一般采用TE缓冲液？

在基因操作实验中，选择缓冲液的主要原则是考虑DNA的稳定性及缓冲液成