流式 蛋白方法总结.pdfVIP

流式与westen在检测蛋白表达方面各有什么优缺点？流式可以检测在胞浆中

表达的蛋白吗？敏感性怎么样？操作上有什么特殊要求？

流式细胞仪当然可以检测细胞内蛋白。流式的应用原理主要还是抗原和抗体反应和western、

免疫组化没有本质差别，但是由于免疫组化和western都有酶催化底物的放大体系，因此，

流式不适合检测低表达的蛋白，低表达的还是采用western（尤其是化学发光底物更佳）和

免疫组化更好。当然，流式最大的一个特点就是，可以定量（百分比），如果是高表达的用

流式细胞仪非常有优势。

流式检测时要求有抗体，可以是直接标记或间接标记的荧光抗体。细胞需要预先固定处理，

常用的是多聚甲醛、TritoonX－100、75％乙醇等，具体步骤可参考相关文献，都有详细说

明。

荧光抗体标记的选择指南：

对于流式检测最初的一步就是选择何种方法，通常是何种荧光物质标记的抗体。厂家根据需

要开发了各种荧光标记的抗体，进行选择时首先要满足的就是所选择的抗体必须在流式上能

够检测，各单位买的流式仪功能不完全一致，首先要和检测方进行联系，看能否检测。在附

表里我将常用的荧光标记物质的激发波长和检测波长给出，可以参考。有几个原则一起说一

下：

1、流式检测时首推荧光物质直接标记的抗体，如果没有直接标记的抗体，用间接发，即二

抗上标记荧光分子同样可以。不过这增加了处理的难度，处理步骤增多，往往会不同程度影

响检测结果。

2、厂家推出的抗体有一些明确写明适合流式检测，而另一些则表明适合免疫组化、western

等，首选前者，可以保质保量，但是后者并不是不可以用，一般来说如果没有明确的表明适

合流式检测的抗体，采用后者也是可以的，不过要注意其检测结果不一定非常理想。

3、单抗和多抗均可应用。

4、绿色荧光蛋白等本身有荧光的物质在检测时会占据一个荧光通道，我也曾碰到几次有人

将转了绿色荧光蛋白的细胞再采用FITC标记的抗体来检测目的蛋白（据说还有人用此方法

得出了满意的结果！），岂不知绿色荧光蛋白和FITC是一个荧光通道，更本不能一起检测。

5、如果是检测淋巴细胞这类细胞，经常用到多种抗体同时标记，选择时切勿选错。我自己

比较倾向于多重标记，因为这样可以减少抗体和细胞用量，特别是对于小鼠的血标本，经常

采到的血量微少，采用多重标记更有利。当然这要求流式操作者有较高的水平，注意调节流

式仪的各种参数。

请问流式细胞术单抗直接荧光需要几种对照？

首先确认你用的直标抗体的荧光染料是什么，再确定该抗体的来源种属，选择相应的同型对

照。如：你现在想检测小鼠淋巴细胞表面的CD4抗原，荧光染料为FITC，抗体来源为大

鼠的IgG1亚型，即RatantiMouseCD4-FITC（IgG1），你所需要的同型对照就应该是Rat

IgG1-FITC，一般的抗体说明上都会写清。

、流式同型对照怎样选择？

同型对照（IsotypeControl）：使用与一抗相同种属来源、相同亚型、相同剂量和相同的免疫

球蛋白及亚型的免疫球蛋白，用于消除由于抗体非特异性结合到细胞表面而产生的背景染

色。如果一抗是多抗，可以用annormalserum（与一抗相同的正常血清）（mustbethesame

speciesasprimaryantibody）。Thiscontroliseasytoachieveandcanbeusedroutinelyin

immunohistochemicalstaining.这个可以咨询试剂商。同型对照为免疫荧光标记中的阴性对

照。由于荧光标记单抗的组来源不同，应选用相同来源的未标记单抗作为同型对照来调整背

景染色。举个例子：比如检测一抗为单抗的mouseantiratCD11b，cloneOX-42purifiedIgG，

那么它的isotype是mouseIgG2a，所以可以用purified（纯化的）mouseIgG2a来做OX-42

的同型对照（IsotypeControl）。一般的的生物技术公司和国内的代理都有出售。

同型对照：是指与MoAb相同的、未免疫小鼠的免疫球蛋白亚类，若使用直接免疫荧光染

色法，同型对照也应标记荧光色素，如IgG1FITC、IgG2ａPE等。主要考虑了细胞的自发

荧光、FC受体介导的抗体结合和非特异性抗体结合等影响因素。此外，同型对照与MoAb

所标记的荧光