DB34T 3208-2018 羊传染性脓疮病毒分离鉴定技术规程.docxVIP

ICS11.220B41

DB34

安徽省地方标准DB34/T3208—2018

羊传染性脓疮病毒分离鉴定技术规程

TechnicalRegulationforIsolationandIdentificationofGoatContagiousEcthymaVirus

2018-10-20发布2018-11-20实施

安徽省质量技术监督局发布

I

DB34/T3208—2018

前言

本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由安徽农业大学提出。

本标准由安徽省农业标准化技术委员会归口。

本标准起草单位：安徽农业大学、安徽省动物疫病预防与控制中心、安徽东方帝维生物制品股份有限公司、安徽省动物卫生监督所、阜阳市动物卫生监督所、亳州市谯城区畜牧兽医局、旌德县畜牧兽医局、阜南县动物疫病预防与控制中心、肥东县动物疫病预防与控制中心、宿州市动物疫病预防与控制中心

本标准主要起草人：王桂军、占松鹤、李雪松、祁克宗、朱良强、张星、张利亚、涂健、徐前明、方保根、冯育宁、陈静、郑举、方定平、兰梦蝶、刘雪梅、周迎春、王军、王楠楠、杨德康、车跃光。

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DB34/T3208—2018

羊传染性脓疮病毒分离鉴定技术规程

1范围

本标准规定了羊传染性脓疮病毒病料采集与处理、病毒分离及病毒鉴定技术要点。本标准适用于羊传染性脓疮病毒的分离与鉴定。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范

3试验材料、试剂和仪器

3.1材料

增殖表皮癌细胞（HeLa）、羊睾丸原代细胞（Lambtestiscells，LT）、DMEM培养基、M199液体培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、0.01mol/LpH7.0～7.4磷酸盐缓冲液（PBS）、青霉素、链霉素。

3.2试剂

DNA提取试剂盒、50×TAE缓冲液、琼脂糖。3.3仪器

细胞培养箱、生物安全柜、高速冷冻离心机、PCR仪、电泳仪、紫外凝胶成像系统。

4样品采集与处理

4.1样品的采集

按照NY/T541的规定执行，无菌采集疑似羊传染性脓疮病毒感染的病羊口唇、蹄部痂皮。4.2样品的保存

样品应置于-80℃冷冻保存。

4.3样品的处理

先将病料组织剪碎、研磨，用灭菌PBS与样品按体积质量比5﹕1匀浆，将样品匀浆冻存后再室温融解，反复三次。经5000r/min离心10min，取上清，并加入青霉素和链霉素，终浓度为2000IU/mL，0.22μm过滤除菌，置于-80℃待用。

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DB34/T3208—2018

5病毒分离

5.1传代细胞培养

使用DMEM培养液复苏HeLa细胞，取T25细胞培养瓶密度达到80%的单层HeLa细胞，弃去培养液，用灭菌PBS清洗三次，接种1mL处理好的样品，于5%C02培养箱，37℃下吸附2h,期间每隔30min轻轻摇晃一次。弃去样品液，用灭菌PBS清洗三次，加入5mL细胞维持液(血清含量为2%),培养箱内继续培养5d。在培养过程中每日观察细胞病变(CPE)产生情况，如出现CPE(特征病变为：细胞间隙增大、细胞核固缩、细胞圆化脱落),收集细胞培养上清及细胞裂解液。

同时设立空白对照(见图1)。

A:病变的HeLa细胞；B:对照细胞

图1接种后第72小时病变的HeLa细胞和对照细胞10×

5.2原代细胞培养

5.2.1原代细胞制作

选择2～3月龄健康雄性绵羊，无菌摘取睾丸，并浸泡于含双抗的M199培养基中保存，将睾丸组织放入平皿中，剥弃髓鞘及白膜，除去脂肪层，用含双抗的灭菌PBS清洗2～3次，放入烧杯中将睾丸组织剪碎，用含双抗的灭菌PBS清洗直至液体清亮，弃去液体，将组织倒入装有玻璃珠的三角瓶中，按组织量的4倍加入胰酶消化液，37℃消化30min,至睾丸组织呈蓬松状，加入M199培养液清洗，将胰酶消化液彻底冲洗干净，加入适量生长液(含10%血清的M199培养基),用玻璃珠振荡法分散细胞，6层纱布进行过滤，取滤液进行细胞计数，用生长液将细胞密度调整为100～150万个/mL的细胞悬液，7mL/瓶(T25细胞培养瓶),置37℃、5