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免疫学诊断技术

军事医学科学院附属医院陈建魁主要内容：

第一节第二节第三节第四节第五节第六节抗原抗体反应免疫学检测常用标记技术免疫细胞的检测免疫分子的检测免疫相关基因的检测免疫学检测方法的应用

第一节抗原抗体反应

抗原抗体反应：抗原与相应抗体在体内或体外发生的特异性结合反应。应用已知抗体或抗原检测未知抗原或抗体，可以对感染性、非感染性致病因子或疾病相关因子进行诊断或辅助诊断。

1、特异性2、适合比例性3、可逆性抗原抗体反应的特异性：

一种抗原一般只能与由它刺激所产生的抗体结合，这种抗原抗体结合反应的专一性即特异性。抗原抗体结合力的大小，常用亲和力(affinity)或亲合力(avidity)来表示。亲和力是指抗体分子上一个抗原结合部位与相应的抗原决定基之间的结合强度。亲合力是指整个抗体

分子与整个抗原之间的结合强度，适合比例性：

抗体含量抗原含量前带

等价带后带

在抗原抗体特异性反应时，当抗原与抗体达到最适比例时，沉淀物形成最多。如果抗原或抗体极度过剩则无沉淀物形成，这种现象称为带现象，出现在抗体过量时，称为前带。在抗原过量时，称为后带。

抗体过剩

抗原抗体比例合适抗原过剩

网格学说(latticetheory)可逆性：

Ag+Ab

K(亲和常数)=AgAb

抗原抗体反应的影响因素

1、电解质浓度2、酸碱度(pH:6~8)3、温度(37~42℃)抗原抗体反应类型；

根据抗原性质、出现结果的现象、参与反应成分的不同，可将抗原抗体反应分为：凝集反应沉淀反应补体参加的反应采用标记物的抗原抗体反应等

颗粒性抗原(细菌、红细胞等)与相应抗体结合后形成凝集团块，这一类反应称为凝集反应(agglutination)。该类反应可检测到ug/ml水平的抗体。

1.直接凝集反应

细菌或红细胞等颗粒性抗原抗体

2.正向间接凝集反应载体颗粒

可溶性抗原例如，用x球蛋白包被的胶乳颗粒，检测病人血清中的抗人γ球蛋白的抗体(类风湿因子)。

3.反向间接凝集反应载体颗粒

抗体

可溶性抗原

可溶性抗原(如：血清蛋白质、细胞裂解液等)与相应抗体结合后出现沉淀物，此类反应称为沉淀反应(precipitation)。

液相沉淀反应

絮状沉淀反应环状沉淀反应

抗血清抗原+一抗原抗体+—免疫比浊法：

在定量抗体中分别加入不同浓度的抗原，经一定时间后可形成免疫复合物。用浊度计测量反应液体的浊度，复合物形成越多，浊度越高，可根据标准曲线计算出样品中的抗原含量。该法快速简便，可取代免疫扩散法测定Ig含量。

凝胶内沉淀反应

免疫扩散技术免疫电泳技术

火箭电泳单向扩散试验对流电泳双向扩散试验免疫电泳

AgAbAg

第二节免疫学检测常用的标记技术

免疫标记技术(immunolabellingtechnique)是指用荧光素、放射性核素、酶、发光剂或电子致密物质(胶体金、铁蛋白)作为示踪剂标记抗体或抗原进行的抗原抗体反应。此类方法具有灵敏、特异、快速，能够定性、定量甚至定位测定，结果易于观察、适合自动化检测等

很多优点。广泛用于各种生物活性物质的分析鉴定与定量检测。根据标记物与检测方法不同，标记技术可分为：

免疫荧光技术放射免疫测定免疫酶标技术发光免疫分析免疫金标记技术主要的免疫标记物

类别荧光素标记物FTC、藻红蛋白(PE)用途免疫组化免疫分析测定放射性核素酶3H、51Cr

、32P、1251、1311

免疫分析测定免疫组化免疫分析测定HRP、AP

化学发光物Luminol金属颗粒胶体金免疫分析测定免疫组化免疫分析测定

用荧光素与抗体连接成荧光抗体，再与待检标本中的抗原反应，抗原抗体复合物散发荧光，借此对标本中的抗原作鉴定和定位。

(一)免疫荧光显微技术

1直接荧光法：将荧光素直接标记抗体，作标本染色。优点：简便易行。缺点：每检查一种抗原必须制备相应的荧光抗体。2间接荧光法：首先用一抗与标本中的抗原结合，再用荧光素标记的二抗染色。优点：敏感性高，制备一种荧光素标记的二抗可用于多种抗原的检查。缺点：非特异性荧光容易增多。3补体结合免疫荧光法行示踪。在抗原-抗体反应时加入补体，使之与抗原-抗体复合物结合；再用荧光素标记的抗补体抗体进

直接法间接法

补体法双标记法

(二)流式细胞术(flowcytometry,FCM)

免疫荧光技术应用于流式细胞仪，可对细胞的表面标志(抗原或受体)进行快速、精确的分析和自动检测，并可将不同类型的细胞分选收集。FCM还可对同一细胞的多种参数(如DNA、RNA、蛋白质和细胞体积等)进行多信息分析，是生命科学研究领域广泛应用的一项新技术。

(三)荧光免疫测定(fluoroimmunoassay,FI