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ELISA法

ELISA是酶联接免疫吸附剂测定(Enzyme-Linked

ImmunosorbnentAssay)的简称。它是继免疫荧光和放射免疫技术之后

发展起来的一种免疫酶技术。此项技术自70年代初问世以来，发展

十分迅速，目前已被广泛用于生物学和医学科学的许多领域。

ELISA基本原理

ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底

物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。由于抗

原、抗体的反应在一种固相载体──聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行，

每加入一种试剂孵育后，可通过洗涤除去多余的游离反应物，从而保

证试验结果的特异性与稳定性。在实际应用中，通过不同的设计，具

体的方法步骤可有多种。即:用于检测抗体的间接法(图a)、用于检测

抗原的双抗体夹心法(图b)以及用于检测小分子抗原或半抗原的抗原

竞争法等等。比较常用的是ELISA双抗体夹心法及ELISA间接法。

ELISA基本操作步骤

方法一用于检测未知抗原的双抗体夹心法:

在包被溶液中稀释纯化的包被抗体(一般0.5-4μg/ml)，将该稀释后的

包被抗体100μl/孔加入到酶标板内。

用封板膜将板封好防止蒸发，在室温(或4℃)孵育过夜。

吸干每一板孔并加洗液洗涤，重复3次。使用洗瓶、多道移液器、多

功能分装器或洗板几，每孔加400μl彻底洗涤。规范的操作要求每步

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完全移出孔中的液体。最后一步，将板中液体移出并将板子在干净的

纸巾上吸附。

加200-300μl/孔封闭液封板，室温至少孵育1小时。

重复步骤3，可利用真空泵干燥板子。加入干燥剂并封板，至少在4-8℃

可贮存2个月。

每孔加100μl适当稀释的标准品和标本，轻轻敲打板子1分钟。贴上

封板膜，室温孵育2小时。

重复步骤3

每孔加100μl经过适当稀释的生物素化的检测抗体，贴上新的封板膜，

室温孵育2小时

重复步骤3

每孔加100μl经过适当稀释的Avidin-HRP或Streptavidin-HRP，也可

加其它种类预先优化物

重复步骤3

每孔加100μl底物溶液，避光，室温孵育5-30分钟进行显色反应

每孔加50μl终止液，轻轻振荡板子确保充分混匀

结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越

深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，

以“+、”“-”号表示。也可测OD值：在ELISA检测仪上，于450nm(若

以ABTS显色，则410nm)处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，

若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。

方法二用于检测未知抗体的间接法：

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用包被缓冲液将已知抗原稀释至1～10μg／ml，

每孔加0.1ml，4℃过夜。次日洗涤3次。

↓

加一定稀释的待检样品(未知抗体)0.1ml于上述已包被

之反应孔

中,置37℃孵育1小时,洗涤。(同时做空白、阴性及阳性

孔对照)