酶和细胞固定化.ppt

2、固定化原生质体第128页,共140页，星期六，2024年，5月一、原生质体固定化的方法制备原生质体——将原生质体重新悬浮在含有渗透压稳定剂的缓冲液中配成原生质体悬浮液——包埋法固定化原生质体。关键：原生质体如何制备？第129页,共140页，星期六，2024年，5月二、原生质体的制备将对数生长期的细胞收集——悬浮在含有渗透压稳定剂的高渗缓冲液中——去细胞壁——分离纯化——得到原生质体——活性鉴定第130页,共140页，星期六，2024年，5月三、酶解注意要点1、酶解前要预处理：主要是为了使酶渗透到细胞器中去。采取的策略：先加入物质抑制或阻止某种细胞壁的成分合成，可以使酶插入。一般加入：巯基乙醇，Triton-100，甘氨酸、青霉素。2、酶系选择：溶菌酶、蜗牛酶、β葡聚糖酶、纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶3、酶浓度选择（0.5%-1%）4、酶解温度和pH5、酶解终点确定第131页,共140页，星期六，2024年，5月四、稳定剂（高渗溶液）要求1加入的化合物对细胞和原生质体无毒性2不会影响水解酶的活性3对代谢产物无不良影响第132页,共140页，星期六，2024年，5月稳定剂加入操作注意点1、一定pH（酶和菌体活性最高）2、一定的浓度（过高浓度原生质体易脱水皱缩）3、种类：无机盐——细菌有机物糖和糖醇——酵母4、易于渗入质膜、易于被原生质体和菌体分解的物质不宜作为稳定剂第133页,共140页，星期六，2024年，5月五、原生质体细胞活性的检测1荧光素双醋酸盐（FDA）染色法2酚藏花红染色法3伊文思兰染色法第134页,共140页，星期六，2024年，5月六、辅酶固定化1、原理有机辅因子中具有某些特殊的化学基团，参与酶的催化反应（递氢、递电子或递某些化学基团的作用）有机辅因子在使用过程中要流失，并且不能自行再生有机辅因子价格昂贵——工业上应用全酶的关键是有机辅因子的保留和再生第135页,共140页，星期六，2024年，5月2、固定化方法与酶相似，一般采用溴化氰法，碳二亚胺法以及重氮偶联法等共价偶联，或将其进行适当的化学修饰后固定在超滤器中。3、辅酶固定化必须解决辅酶在多个酶之间传递的障碍。策略：先在辅酶的一定部位进行修饰--引入功能团和间隔臂（形成辅酶衍生物）--再与水溶性高分子结合第136页,共140页，星期六，2024年，5月辅酶的固定化第137页,共140页，星期六，2024年，5月第138页,共140页，星期六，2024年，5月辅酶再生的形式：辅酶和酶共固定 与酶分子偶联成辅酶-酶复合物第139页,共140页，星期六，2024年，5月感谢大家观看第140页,共140页，星期六，2024年，5月**********吸附法优缺点操作简便易行对细胞的生长、繁殖和新陈代谢没有明显的影响吸附力较弱、吸附不牢固细胞容易脱落，使用受到一定的限制第96页,共140页，星期六，2024年，5月2.2包埋法将细胞包埋在多孔载体内部凝胶包埋法以各种多孔凝胶为载体，将细胞包埋在凝胶的微孔内而使细胞固定化的方法。细胞经包埋固定后，被限制在凝胶的微孔内进行生长、繁殖和新陈代谢半透膜包埋法第97页,共140页，星期六，2024年，5月凝胶包埋法应用最广泛适用于各种植物细胞、动物细胞和微生物细胞使用的载体海藻酸钙凝胶、角叉才胶、明胶、聚丙烯酰胺凝胶、光交联树脂、琼脂等第98页,共140页，星期六，2024年，5月①琼脂凝胶包埋法第99页,共140页，星期六，2024年，5月也可将琼脂细胞混悬液摊成薄层，待其冷却凝固后，在无菌条件下，将固定化细胞胶层切成所需的形状缺点琼脂糖凝胶的机械强度较差氧气、底物和产物的扩散比较困难应用受限第100页,共140页，星期六，2024年，5月琼脂凝胶第101页,共140页，星期六，2024年，5月②海藻酸钙凝胶包埋法第102页,共140页，星期六，2024年，5月操作简便、条件温和、对细胞无毒性通过改变海藻酸钠的浓度可以改变凝胶的孔径，适合多种细胞的固定化磷酸盐（营养液中）会破坏凝胶的结构，应控制好其浓度在营养液中保持一定浓度的钙离子，维持凝胶结构的稳定性第103页,共140页，星期六，2024年，5月海藻酸钙凝胶第104页,共140页，星期六，2024年，5月③角叉菜胶包埋法溶解、灭菌、冷却到35-50℃与细胞悬浮液混匀后滴到预冷的氯化钾溶液中，制成小球状固定化细胞胶粒也可按需制成片状或其它形状凝聚成型时可使用其它阳离子，如NH4