生化大实验实验报告.pdfVIP

一蛋白质提取、纯化及分析技术

实验一多酚氧化酶（PPO）的分离提取

一、材料与试剂

（1）马铃薯（大约每小组200-300g）

（2）试剂：

0.03M磷酸缓冲液PH6.0(内含0.02m巯基乙醇，0.001mEDTA，5%甘油，1%的聚乙烯吡

咯烷酮)配制时配×10倍的浓缩液1000ml；固体硫酸铵；0.03M磷酸缓冲液PH6.0（内含0.02m

巯基乙醇，0.001mEDTA，0.005mMgCL）配置时配。

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（3）实验器械与仪器设备：

试管与试管架；烧杯、玻璃搅棒；移液管、滴管等；试剂瓶；透析袋；过滤纱布；植物

组织匀浆器；PH计和PH试纸；GL-20C高速冷冻离心机；

DL-7A大容量低速冷冻离心机

二、操作步骤

1：粗酶提取：

马铃薯组织按1：1（W/V）比例与0.03m磷酸缓冲液PH6.0（内含0.02M巯基乙醇，0.001m

EDTA，5%甘油，1%聚乙烯吡咯烷酮）混合，匀浆4层后纱布过滤，滤液以6000rpm离心10min，

弃除沉淀获得酶提取液。

2：盐析分级沉淀：

在酶提取液中加入固体硫酸铵使其达到40%饱和度（边加边搅拌达到充分溶解），然后

6000rpm离心20min弃除沉淀；离心上清液在加入固体硫酸铵达到70%饱和度（边加边搅拌

达到充分溶解），再以6000rpm离心20min，弃除上清夜，收集粗酶沉淀。沉淀用0.03M磷

酸缓冲液PH6.0（内含0.02巯基乙醇，0.001MEDTA，0.005MMgCL）溶解，装入透析袋

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中用0.02NKCL溶液透析至无硫酸铵根离子，获得粗酶液供上柱使用。

三、实验结果

获得PPO粗酶液供上柱使用。

实验二柱层析纯化PPO

一、材料与试剂

试剂：0.02MTris-HCL缓冲液Ph7.4(内含0.001MEDTA)配制时配×10倍浓缩液

1000ml;NaCL;聚已二醇；葡聚糖凝胶SephadexG-200等；

实验器械与仪器设备：试管与试管架、烧杯、玻璃搅棒、移液管、滴管等；试剂瓶、层

析柱、pH计和pH试纸、恒流泵、梯度混合仪、核酸蛋白监测仪、GL-20C高速冷冻离心机、

DL-7A大容量低速冷冻离心机

二、操作步骤

1．葡聚糖凝胶的处理、装柱及平衡

（1）柱材处理

称取一定量的SephadexG-200干粉，加无离子水或蒸馏水浸泡溶胀48h,去掉悬浮的细

微颗粒，为防止凝胶颗粒中的空气存在，影响层析效果，凝胶装柱前一定要将凝胶液中的气

体除掉，其办法是将凝胶液放进抽滤瓶中，进行抽真空处理，直到凝胶液中没有气泡出现为

止。

（2）装柱

将层析柱清洗干净垂直固定到层析架上，加1/3体积的无离子水，打开下出液口，水流

畅通，即刻将小烧杯中装有适宜浓度的凝胶液（凝胶的浓度过高会产生气泡，影响蛋白质分

离速度，浓度过低易产生凝胶分层，影响蛋白质的分离效果）轻轻倒入层析柱中，凝胶自然

慢慢沉降在层析柱底部，凝胶沉积直到离层析柱上端1.5-2cm处，停止装柱，剪一与柱内径

相等的滤纸片覆盖于凝胶上。层析柱上端进液口连接恒流泵，下出液口连接蛋白质监测仪，

待层析柱的平衡。

（3）平衡

在柱层析上样前必须对层析柱进行平衡，所谓平衡就是将层析柱中的溶液用层析过程的

缓冲液（洗脱液）置换出来，使层析柱中的缓冲系统与柱层析过程中的系统一致。其方法是：

利用层析柱上端的恒流泵将平衡缓冲液泵入到层析柱内，打开层析柱下端的出口，平衡液流

速在0.5-1ml/min，当下出口流出液的PH值与平衡缓冲液的PH值一致时，层析柱达到了平

衡。在本实验中，用0.002MTris-HCL缓冲液PH7.4(内含0.0001MEDTA)，平衡SephadexG-200

凝胶。

2．上样：将粗酶液上柱。

3．洗脱：用0.02MTris-HCL缓冲液Ph7.4（内含0.001MEDTA）洗脱，收集洗脱液进行酶

活性、蛋白质浓度、聚丙烯酰胺凝胶电泳分子量的基本性质分析测定。

4．测定酶活性和蛋白质浓度

注释：透析就是把（NH）2SO4透析出去