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鱼类病原微生物的检测方法

鱼类病原体的检测方法很多，本文介绍了传统的方法：直接培养法、组织切

片观察法；免疫学检测方法：单克隆抗体检测、免疫荧光技术、酶联免疫吸附

（ELIST）技术；分子生物学检测技术；PCR（聚合酶链反应）技术、核酸杂交

技术。新的检测方法的应用，为水产养殖病原体检测，以及疾病防治等带来了技

术革命，并显示出巨大的潜力。

1传统检测方法

1.1组织切片观察法

选择待检测鱼体病灶处作组织切片，在显微镜下观察，以此检测病原。一般

准确性较差，并且较小的病原体检测困难。

1.2选择性培养法

选择性培养基就是根据某种微生物的特殊营养要求或其对某化学、物理因素

的抗性而设计的培养基，其功能是使混合菌样中的劣势菌种变成优势菌，从而提

高该菌的筛选效率。这种培养基是在上世纪末由荷兰的M.W.Beijerinck和俄国的

S.N.Vinogradsky发明的。

由于选择性培养基制作费用低，使用方便，因此国外常将其作为日常诊断的

主要方法。例如用EIM培养基可识别斑点叉尾鮰的肠杆菌。在25℃培养48h，

EIM培养基能抑制多数鱼类病原菌、真菌和病毒生长，而使Eictaturi菌落呈绿色，

半透明，直径0.5—1.0mm，其它菌落则呈褐色、红色、黄绿色、褐绿色，直径

大于2mm。Rimler-shotts培养基则可用来检测腐皮病病原嗜水气单胞杆菌，37℃

培养20-24h可使嗜水气单胞杆菌菌落呈黄色，其它菌落则呈现另外的颜色。使

用选择性培养基时，温度和时间很重要。同是使用Rider-shotts培养基37℃和37℃

以下培养，检测出呈黄色的菌落分别为嗜水气单胞杆菌和杀鲑气单胞杆菌。这种

方法简单、实用，但培养时间还是过长。另外它只能粗略检测，不能做到精确，

要确切鉴别，还要通过免疫学等的检测方法加以确定。

2免疫学检测方法

2.1单克隆抗体方法

单克隆抗体，是一个抗体产生的细胞与一个骨髓瘤细胞融合而产生杂交瘤细

胞，经无性繁殖的细胞群所产生的。单克隆抗体与常规血清抗体相比，特异性强，

能识别单一抗原决定簇，能通过保持细胞系重复获得相同抗体。

目前该技术已在水产养殖中得到广泛应用，如诊断海湾扇贝的腮立克次氏

体、诊断鱼类及牡蛎相结合的淋巴细胞病毒、检测菲律宾蛤仔棕环病病因弧菌。

另外，近年来已有人利用此技术制备了抗鳗弧菌的单克隆抗体和抗嗜水气单胞菌

外毒素的单克隆抗体。据陈琼等1996年报道，利用该技术制备单克隆抗体可用

于提纯嗜水气单胞菌hec毒素。Austh（1986）报道了抗耶尔森氏苗和杀鲑气单

胞菌的单克隆抗体，并把它们应用于鲑鳟鱼类红嘴病及疖疮病的快速诊断中。

2.2酶联免疫吸附检测法（ELISA）

酶联免疫吸附检测（ELIST）是将抗原或抗体吸附在固相载体表面，使抗原

抗体反应在固相载体表面进行的一种检测技术。

ELISA的基本原理有三条：

2.2.1抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面，可能是蛋白和聚苯乙

烯表面间的疏水性部分相互吸附，并保持其免疫学活性。

2.2.2抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍

能保持其免疫学和酶学活性。

2.2.3酶結合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的颜色反应来判

定是否有免疫反应的存在，而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量

成正比例的，因此，可以按底物显色的程度显示试验结果。

目前ELISA法在水产养殖病原体诊断尤其在鱼病学诊断上应用较广。国内

如钱冬普等1993年用该法检测细菌性败血症病原——嗜水气单胞菌，陈怀青等

1993年应用Dot——ELISA法检测鱼类致病性嗜水气单胞菌hec毒素，黄等1995

年利用单克隆抗体酶联免疫技术检测对虾皮下造血组织坏死病病毒，李焕荣等

1997年应用Dot——ELISA法快速检测嗜水气单胞菌的致病因子胞外蛋白酶

AhEcPase,均取得较为满意的效果。国外则较早用ELISA法对疖疮病、红嘴病、

细菌性肾脏病和爱德华氏菌病等鱼类疾病进行快速诊断。另外，Noel等利用该

法鉴定导致菲律宾哈仔患棕环病的弧菌。

3分子