蛋白质的裂解教案资料.pptVIP

蛋白质的裂解;（－）简述

用特异性水解酶裂解肽链有许多优点：专一性强，降解后的肽段容易纯化，产率较高，副反应少，在酸水解中容易受破坏的谷氨酰氨、天冬酰氨和色氨酸等在酶解中都不受影响。

整个酶解反应中，酶解条件的选择相当重要，需要考虑下列因素：

（1）合适的pH

（2）适宜的反应温度

（3）恰当的酶与底物的比率

（4）选择相应的反应时间;;最常用的水解蛋白酶，专一性强,只断裂赖氨酸和精氨酸的羧基所形成的肽键，用它裂解蛋白质常常可得到合适的肽段;讨论：

如果蛋白质分子量较大，或遇到碱性蛋白含有较多的赖氨酸和精氨酸残基时，则酶解后的肽段数就会很多，将给顺序测定带来很大麻烦。

方法：用柠康酸酐可逆保护赖氨酸的ε-氨基，使胰蛋白酶酶解时不会在赖氨酸羧端裂解，而只在精氨酸的羧端裂解，以后也很容易去掉保护基团。;;凝凝乳蛋白酶的前体是胰凝乳蛋白酶原，由245个氨基酸组成的单链，有5个二硫键。酶原本身没有水解活力，靠胰蛋白酶激活，在Arg15---Ile16肽键处水解，形成л-胰凝乳蛋白酶。

而л-胰凝乳蛋白酶又反过来对本身起作用，酶解掉二个二肽Ser14-Arg15和Thr147-Asn148，生成具完全活力的a-胰凝乳蛋白酶。

因此a一胰凝乳蛋白酶由A、B、C三条多肽链组成，它们分别含有13，130，96个氨基酸残基。

;凝凝乳蛋白酶的专一性不如胰蛋白酶，

酶解Tyr，Phe、Trp、Len等疏水氨基酸羧基所形成的肽链，

也能在val、Ile、Ser、Gly的羧端裂解，但较慢。如果被裂解的邻近基团是碱性的（如Lys、Arg或His），裂解能力将增加。倘若邻近是Pro或Phe—Pro，则不能酶解。

在酶解中，增加酶的比例（对底物）能提高酶解能力，这时，甚至象Ala-val键也能酶解。;专一性与胰凝乳蛋白酶类似

适宜酶解pH值是2

在顺序测定中很有价值，因为在确定二硫键的位置时，在这样的酸性环境下二硫键比较稳定，很少有二硫键的互换反应。反应条件选择恰当，可以变低特异性为高特异性。;含金属的酶，锌原子和钙原子，锌是活力所必需的，钙使酶在高温下稳定，该酶易被EDTA所??制。

专一性比上面三种酶都差，用来直接酶解蛋白质不太合适，因为产生的肽段相对较多，不仅纯化起来麻烦，而且对以后的顺序重排也不利。如用它来裂解次级肽，即先用专一性较强的酶或化学试剂把蛋白质多肽链降解成大肽段，再切成小肽段时，嗜热菌蛋白酶可发挥很好的作用。

胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶和嗜热菌蛋白酶有一个共同的特点，即它们的作用范为比较宽，并且主要裂解中性氨基酸残基。;（三）几种高特异性的肽链内切酶

在蛋白质顺序测定中，对较大分子量的蛋白质采用逐级特异性裂解是比较理想的。;Glu蛋白酶

Glu蛋白酶亦称金黄色葡萄球菌蛋白酶，是从金黄色葡萄球菌菌株V8中分离得到的，是最有效、应用最广泛的一个酶，分子量只有12,000。

当酶解在磷酸缓冲液（pH7.8）中进行时，它能在谷氨酸和天冬氨酸残基的羧端处裂解肽键。

用碳酸氢铵（pH7.8）或醋酸胺（pH4.0）时，则仅在谷氨酸的羧端处裂解。

该酶对下列蛋白质只在谷氨酸的羧端处裂解：核糖体蛋白S7，L23，EL12，维生素A1结合蛋白,钙结合蛋白，a1[lll］胶原蛋白,?2小球蛋白。;Arg蛋白酶

（1）Chostripain酶专一性裂解精氨酸羧端的蛋白酶。

专一性很高；肽链的羧端是精氨酸；该酶在6mol

／l尿素20小时内仍保持活力，这样对不溶性蛋白质

的长时间裂解就很有效。

（2）凝血酶（thrombin）是另一个作用精氨酸羧端的

特异酶,对Arg-Gly键裂解特别快。

(3)颌下腺蛋白酶也有裂解精氨酸所形成的肽键的专一

性,对磷脂酰胆碱交换蛋白只裂解Arg-Glu键，对

血纤维蛋白原只裂解Arg-Arg键。;Lys蛋白酶

选择性一般不如Arg蛋白酶专一

1）密环菌（Armillariamellea）是裂解赖氨酸氨端肽键,条件是在赖氨酸残基的羧端必须联有谷氨酸、天冬氨酸或天冬酰胺残基。这个酶对精氨酸也具有活力，如在酶解天冬氨酸氨转移酶时，发现它在部分赖氨酸残基氨端