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线粒体耳聋基因(mtDNA)突变检测标准操作程序
1检验目的
保证受检者线粒体(mtDNA)耳聋基因突变检测的准确、可靠。
2检验原理
采用PCR扩增和基因测序方法检测mtDNAA1555G、C1494T两个位点基因
突变情况。
3性能参数
3.1敏感性：PCR测序所需模板的量较少，一般PCR产物需30~90ng，单链DNA
需50~100ng，双链DNA需200~500ng；
3.2特异性：采用BigDye荧光标记终止底物循环测序试剂盒，一般可测DNA
长度为650bp左右；
3.3精确度：DNA测序精确度为(98.5±0.5)%；
3.4简便安全：采用ABI3130自动化测序仪，能自动灌胶、自动进样、自动数
据收集分析等。
3.5快速：每组基因测序可在40min完成。
4原始样品系统
外周血。
5容器和添加剂类型
EDTA抗凝管(血常规管)。
6所需设备和试剂
6.1仪器设备
ABI9700PCR仪，ABI3130测序仪，凝胶成像系统。
6.2试剂盒
6.2.1提取外周血DNA：采用上海赛百盛试剂盒快速提取外周血DNA；
6.2.2Axygen公司提供的胶回收试剂盒；
6.2.3ABI公司提供的BigDye测序反应试剂盒：主要试剂是BigDyeMix，内
含PE专利四色荧光标记的ddNTP和普通dNTP，AmpliTaqDNApolymerase
FS，反应缓冲液等；
6.2.4测序反应产物纯化：醋酸钠/乙醇法纯化PCR产物。
7校准程序
厂家工程师完成。
8程序步骤
8.1全血DNA提取试剂盒提取DNA
8.1.1GN结合液预热澄清后使用；
8.1.2将0.3-0.5ml全血加入到1ml纯化树脂中，颠倒混匀5-6次。室温下
温育3min，期间颠倒混匀一次，5000rpm离心3sec，收集沉淀；
8.1.3用1mlGN结合液将纯化树脂悬浮，颠倒混匀，5000rpm离心3sec，
收集沉淀；
8.1.4用0.5ml漂洗液漂洗纯化树脂两次，颠倒混匀，5000rpm离心3sec，
收集沉淀；
8.1.5用0.8ml无水乙醇悬浮，装入离心纯化柱，12000rpm离心1min，倒
掉废液收集管中的乙醇，再次离心1min，尽量除尽乙醇；
8.1.6将离心纯化柱套入一个干净的1.5ml离心管中，加入100μl超纯水于
纯化树脂中，室温下放置3min，12000rpm离心2min，-20C备用。
8.2mtDNAPCR核酸扩增
准备已做好标记的PCR反应管若干，阴性对照上清液及阳性对照及标本各
2μl，再分别加入2×Premix10ul、引物1.0ul、模板2.0ul、灭菌去离子水7ul
，反应总体积为20ul；盖紧管盖，低速离心数秒，放入ABI9700PCR检测仪内
进行PCR。
8.2.1PCR扩增循环条件
TemperarureIncubationTime
Programcycles(C)(min:sec)
11425：00
21953：00
340940：30
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