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CRISPR-Cas9

CRISPR-Cas系统的发现

1CRISPR-Cas是很多细菌和大部分古生菌的天然免疫系统，通过对入侵的病毒和核酸进行特异性的识别，利用Cas蛋白进行切割，从而达到对自身的免疫。2CRISPR-Cas系统赋予原核细胞针对外源DNA特异性免疫,而这种特异性是由间隔序列（spacer）决定的。在宿主防御噬菌体攻击中，针对自然界中庞大的噬菌体种群，细菌进化了CRISPR介导的适应性免疫。这种免疫功能的发挥是由CRISPR间隔序列的动态性变化，即通过增加或删除间隔序列（spacer）来实现的。

CRISPR-Cas概述CRISPR-Cas：一种来源是细菌获得性免疫的由RNA指导Cas蛋白对靶向基因进行修饰的技术

CRISPR-Cas概述

CRISPR-Cas主要由两部分组成识别切割

CRISPR结构

CRISPR是一个特殊的DNA重复序列家族,广泛分布于细菌和古细菌基因组中。CRISPR位点通常由短的高度保守的重复序列(repeats)组成,重复序列的长度通常21~48bp,重复序列之间被26~72bp间隔序列(spacer)隔开。CRISPR就是通过这些间隔序列（space）与靶基因进行识别。

Cas家族Cas（CRISPRassociated）：存在于CRISPR位点附近，是一种双链DNA核酸酶，能在guideRNA引导下对靶位点进行切割。它与folk酶功能类似，但是它并不需要形成二聚体才能发挥作用。

Cas分类因为Cas基因多样性异常丰富，简单的分类很难区分那些同源但功能并不相关的Cas蛋白[30]．多个研究小组共同提议，考虑多个因素，包括保守性的Cas蛋白之间的进化关系及Cas基因操纵子的组成方式等，将CRISPR/Cas的免疫机制分为相对独立的层次：第一个层次主要是对外来信息的处理和加工，形成免疫记忆，也就是新的间隔序列的获得，主要由通用的核心蛋白Cas1和Cas2参与完成；第二个层次主要为初级CRISPRRNA成熟以及识别和降解入侵的外源遗传物质．按照该分类标准可以将CRISPR/Cas系统分为：TypeⅠ、TypeⅡ、TypeⅢ三种不同类型

Cas9TypeⅡ系统的主要特征是包含一个标志性的Cas9蛋白(分子质量很大的多功能蛋白)参与crRNA的成熟以及降解入侵的噬菌体DNA或是外源质粒。Cas9蛋白包含两个功能结构域，一个在N端，有类似于Ruc核酸酶的活性，一个在中部有类似HNH核酸酶的活性。嗜热性链球菌具有典型的TypeⅡCRISPR/Cas系统，它的CRISPR/Cas系统编码tracrRNA(trans-activatingcrRNA)，其指导RNaseⅢ和Cas9完成前体crRNA的成熟。随后tracrRNA还能与成熟的crRNA的重复序列配对形成RNA二聚体，进而和Cas9蛋白结合成核糖核蛋白复合体，发挥识别和降解入侵的外源DNA功能[36]．

CRISPR-Cas9原理此系统的工作原理是crRNA（CRISPR-derivedRNA）通过碱基配对与tracrRNA（trans-activatingRNA）结合形成tracrRNA/crRNA复合物，此复合物引导核酸酶Cas9蛋白在与crRNA配对的序列靶位点剪切双链DNA。而通过人工设计这两种RNA，可以改造形成具有引导作用的sgRNA（shortguideRNA），足以引导Cas9对DNA的定点切割。作为一种RNA导向的dsDNA结合蛋白，Cas9效应物核酸酶是已知的第一个统一因子（unifyingfactor），能够共定位RNA、DNA和蛋白，从而拥有巨大的改造潜力。将蛋白与无核酸酶的Cas9（Cas9nuclease-null）融合，并表达适当的sgRNA，可靶定任何dsDNA序列，而sgRNA的末端可连接到目标DNA，不影响Cas9的结合。因此，Cas9能在任何dsDNA序列处带来任何融合蛋白及RNA，这为生物体的研究和改造带来巨大潜力。

应用基因敲除动物模型一直以来是在活体动物上开展基因功能研究、寻找合适药物作用靶标的重要工具。但是传统的基因敲除方法需要通过复杂的打靶载体构建、ES细胞筛选、嵌合体小鼠选育等一系列步骤，不仅流程繁琐、对技术的要求很高，而且费用大，耗时较长，成功率受到多方面因素的限制。即使对于技术比较成熟的实验室，利用传统技术构建基因敲除大、小鼠一般也需要一年以上。[2]2013年1月份，美国两个实验室在《Science》杂志发表了基于CRIS