酶学第二讲课件.pptVIP

第二章酶的分离和纯化

IsolationandPurificationofenzyme方法概括原料处理：包括组织破碎、缓冲液抽粗分级：一般采用硫铵沉淀、乙醇沉淀或其他方法细分级：一般采用离子交换层析、凝胶层析、亲和层析和电泳

第一节原料选择及预处理动物原料：动物组织或脏器（活体取出）充分脱血-10℃—-50℃保存植物原料：植物原料磨碎加入缓冲液抽提植物原料特点：1）纤维含量高2）酚酶活力高3）缓冲液pH易被细胞内物质改变微生物原料：菌体培养做酶活—时间曲线确定最大酶活时间

第二节酶的粗提沉淀核酸沉淀：a）MnCl2、硫酸鱼精蛋白、链霉素可使核酸沉淀，离心除掉（b）加入核酸酶将其降解杂蛋白沉淀：根据目的酶的特性方法各异选择性沉淀（盐析）：最常用的方法

沉淀过程中随时监测蛋白浓度和酶活力讨论：（a）盐的加入速度合适（b）蛋白质开始沉淀处的硫铵浓度与蛋白浓度有关（c）硫铵浓度表示法；饱和度25℃4.1M（d）硫铵饱和溶液pH7，若目的酶易酸变性必须用缓冲液（e）硫铵溶液密度较高（1.24），故需较大离心力此步可除去75%以上的杂蛋白，且可使蛋白浓缩

透析与浓缩1）透析袋处理：透析袋0.5MEDTA煮半小时蒸馏水煮半小时反复八次带橡皮手套用镊子拿取2）透析除盐：200倍于被透析物；4小时换一次透析液；监测电导值SephadexG25除盐：柱长50cm；上样小于床体积的20%3）浓缩：a）火棉胶b）聚乙二醇（PEG）c）超滤（3-5kg/cm2）d）冻干

透析技术原理图

第三节酶的精制一、层析技术（chromatography）1）分配层析：物质在两相中的分配系数不同a）纸层b）薄层(比纸层灵敏100倍但剥板困难)c）柱层2）吸附层析（absorptionchromatography）：吸附剂对通过它的物质吸附力不同，吸附力包括离子引力、疏水作用、范德华力和氢键a）薄层b）柱层填料一般为硅胶、氧化铝、磷酸钙、活性白土和羟基磷灰石；常用羟基磷灰石;带正电,稳定范围pH5.5-10,吸附量1mg/g湿剂

薄层

f）柱层析：床体积等于2-5倍束缚样品需要量；径∶高=1∶15；上样量不超过柱体积的10%（*注意上样方法）；洗脱方法有两种——不连续梯度洗脱和连续梯度洗脱；分布收集器收集每管2-3mlg）交换剂后处理：饱和NaCl→水→酸或碱→水→平衡

连续梯度洗脱梯度混合器

离子交换层析阳离子交换剂阴离子交换剂

Anionexchangechromatography

4）凝胶层析（分子筛层析）（gelfiltrationchromatography）：根据分子量大小予以分离a）凝胶预处理：凝胶→浸入洗脱液→轻轻搅拌↓加热90-100℃（水浴加热）b）层析柱准备：φ2.5×100柱；稠胶灌柱；2-3个床体积的缓冲液平衡；流速16-18ml/hc）层析：兰葡聚糖（分子量2×106）验柱并求外水体积（V0）；上样量1-5%；恒压洗脱；流速16-18ml/hd）凝胶后处理：0.5NNaOH+0.5NNaCl处理后4℃保存长时间不用可采用乙醇脱水保存或低温干燥保存

Gelfiltrationchromatography

5）亲和层析（affinitychromatography）

特异性结合a）关键：配体；配体与支持物的连接方法；吸附、洗脱条件b）支持物的选择：非特异性吸附作用低；液体流动性好；较宽的pH、离子强度；丰富的化学基团；有效的多孔性常用琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶和受控多孔玻璃球c）配体的选择：有亲和力但不易过大d）配体与支持物的连接：载体结合法；物理吸附法；交联法；包埋法（先活化支持物上的功能基团再将配体连上去）e）?吸附剂的衍生物：支持物+空间臂f）?层析条件的选择：蛋白质+配体→蛋白质-配体复合物起初配体浓度恒定，随蛋白浓度增加平衡右移（逐渐保留特性），故亲和力较低也能成功的亲和。g）洗脱：更高亲和力的物质置换；剧烈改变环境条件

Affinitychromatography

二、超离心技术利用物质的沉降系数、质量、浮力因子等方面的差别用强离心力进行分离F=w2r（F—相对离心力RCF；RCF以g的倍数表示）RCF=w2r/980w=π(转数/分）/