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iTRAQ技术简介

iTRAQ技术

???????iTRAQ技术是由美国应用生物系统公司(AppliedBiosystemsIncorporation，ABI)2004年开发的同位素标记相对和绝对定量(isobarictagsforrelativeandabsolutequantitation，iTRAQ)技术，是一种新的、功能强大的可同时对四种样品进行绝对和相对定量研究的方法，这种方法是建立在iTRAQ试剂的基础上。

iTRAQ技术原理：?

??????iTRAQ试剂为可与氨基酸N端及赖氨酸侧链连接的胺标记同重元素(isobaric)。在质谱图中，任何一种iTRAQ试剂标记的不同样本中的同一蛋白质表现为相同的质荷比。

???????在串联质谱中，信号离子表现为不同质荷比(114～117)的峰，因此，根据波峰的高度及面积，可以得到蛋白质的定量信息。

iTRAQ试剂结构：

?iTRAQ试剂是一种小分子同重元素化学物质，包括三部分：

?一端是报告部分reportergroup

?另一端是肽反应部分peptidereactivegroup

?中间部分是平衡部分balancegroup

其中：reportergroup：质量为114Da、115Da、116Da、117Da，因此iTRAQ试剂共四种。

??peptidereactivegroup：将reportergroup与肽N端及赖氨酸侧链连接，几乎可以标记样本中所有蛋白质。

??balancegroup：质量为31Da、30Da、29Da、28Da，使得四种iTRAQ试剂分子量均为145Da，保证iTRAQ标记的同一肽段m/z相同。

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图1iTRAQ试剂结构

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图2iTRAQ试剂标记原理

综上：

?4个来源不同的相同蛋白样品在一级质谱上表现相同

?Balancegroup在二级质谱发生中性丢失

?Reportergroup在二级质谱产生４个报告离子，分别是114、115、116和117

?通过分析报告离子的峰强度比值就可以分析同一个蛋白在不同样品间的表达量比值

操作流程：

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iTRAQ技术主要特点：

1.分离能力强、分析范围广

2.定性分析结果可靠，可以同时给出每一个组分的分子量和丰富的结构信息

3.MS具备高灵敏度、检测限低

4.分析时间快，分离效果好

5.自动化程度高

6.iTRAQ技术不仅可发现胞浆蛋白，还有膜蛋白、核蛋白、胞外蛋白

iTRAQ技术可检测出低丰度蛋白、强碱性蛋白、小于10KD或大于200KD的蛋白

iTRAQ技术是由美国应用生物系统公司(AppliedBiosystemsIncorporation，ABI)2004年开发的同位素标记相对和绝对定量(isobarictagsforrelativeandabsolutequantitation，iTRAQ)技术，是一种新的、功能强大的可同时对四种样品进行绝对和相对定量研究的方法，这种方法是建立在iTRAQ试剂的基础上。

AB公司itraq技术平台：

1.?寻找差异表达蛋白，并分析蛋白功能。

2.?定性与定量分析蛋白：分析结果可得出各样品中蛋白名称及蛋白量的比值

3.?差异基因筛选：利用统计学方法筛选差异表达的蛋白和差异表达的基因

4.?Pathwayenrichment分析：找出差异表达基因在生物学通路中的位置，以阐明其生物学功能以及不同基因之间的相互作用。

图3红色代表上调的基因/蛋白，绿色代表下调的基因/蛋白

5.?转录因子预测分析：分析每个转录因子在上调基因和下调基因的分布情况，寻找有差异的转录因子。

图4黄色为差异蛋白，天蓝色为转录因子

iTRAQ技术-样品准备

1.蛋白运输：24小时内可以4度运输

2.蛋白长期保存：-20度

3.待检测蛋白要求：蛋白量最低50ug，浓度最低要为5ug/uL10ul，否则同位素无法标记。

4.蛋白提取试剂要求：使用普通的组织、细胞裂解液即可，切忌不要使用二维电泳试剂提取。