海洋动物资源线粒体DNA遗传多样性监测技术规程.docx

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海洋动物资源线粒体DNA遗传多样性监测技术规程

范围

本文件确立了海洋动物资源线粒体DNA遗传多样性监测程序，规定了监测方案设计、样品采集、保存与运输、样品检测、质量控制、监测报告等技术要求，描述了数据分析方法。

本文件适用于海洋动物资源的遗传多样性监测。

规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T12763.6海洋调查规范第6部分：海洋生物调查

GB/T18654.2养殖鱼类种质检验第2部分：抽样方法

术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

遗传多样性geneticdiversity

种内不同群体之间或一个群体内不同个体的遗传变异总和。

监测程序

海洋动物资源线粒体DNA遗传多样性监测程序包括监测方案设计、样品采集、保存与运输、样品检测、质量控制、数据分析、监测报告，程序见图1。

监测程序图

监测方案设计

明确监测海域、监测周期、监测时间、样品采集、保存和运输、样品检测方法、监测指标、质量控制、数据分析、监测报告等。其中，对调查海域某种野生海洋动物资源的遗传多样性监测，宜每5年～10年开展1次；对人工增殖物种宜每年开展1次。

样品采集、保存与运输

采样地点

采样地点可根据调查需求选择：

现场调查采样：按GB/T12763.6规定执行。对海洋底栖动物、潮间带动物进行定点采样，对移动迅速的底栖动物可设地笼诱捕。对游泳能力强的鱼类、甲壳类等进行拖网采样；

非现场调查采样：从调查海域捕捞作业船、渔港或市场直接采集来自目标海域的新鲜渔获物，采样方法按GB/T18654.2规定执行。

采样数量及方法

按形态学分类后，每个调查海域应采集同一物种30个以上独立个体作为一批样品；保护动物和珍稀濒危动物难以达到该数量的，可积累该海域一定时期内多次调查采集的不同个体，以实际采集到的个体数为准。根据监测对象不同，可分别选择以下采样方法：

通常采取海洋动物整体；

对大型海洋动物实行部分采样，取肌肉组织约0.5?g；

对海洋保护动物、珍稀濒危生物实行非致死性采样：

视监测生物的具体情况，无菌操作剪取部分鱼类鳍条组织约0.1?g，或用无菌注射器于尾静脉处抽取血液约0.5?mL；

贝类无菌取小部分外套膜组织；

蟹类用无菌注射器从第3步足基节关节膜处刺入抽取血淋巴0.1?mL。

采样记录

采集的每批样品分别填写样品采集记录，格式参见附录A。

样品保存与运输

整体采样的个体应保持完整；部分采样的组织应每个个体独立包装。采样后宜立即冷冻保存，不具备冷冻条件的4?℃～10?℃冷藏，冷藏时间不宜超过24?h。样品运输过程中应保证温度在10?℃以下。体积小于1?cm3的样品或组织，可量取加入10倍以上体积的乙醇（95%以上）或商品化的样品保存溶液浸泡，常温保存与运输。

样品检测

方法原理

利用聚合酶链式反应（polymerasechainreaction，PCR）技术、脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid，DNA）测序技术和生物信息学分析技术，对海洋动物线粒体DNA中进化速度最快的部分序列，通常采用线粒体控制区（D-loop）序列，不适用D-loop序列的物种可采用细胞色素b（cytochromeb，Cytb）、细胞色素氧化酶I（CytochromeoxidaseI，COI）基因或其他线粒体基因序列，进行单核苷酸多态性分析，获得群体的遗传多样性数据。

DNA提取

取海洋动物肌肉或鳍条组织约0.1g，液氮冷冻研磨、组织匀浆或剪碎后，用酚-氯仿法或动物组织DNA提取试剂盒提取总DNA；血液样品用血液DNA提取试剂盒提取总DNA。样品检测所用设备和试剂参见附录B。酚-氯仿法提取DNA的步骤参见附录C；用商品化试剂盒提取DNA，操作步骤按说明书进行。

DNA质量检测

提取的DNA用洗脱液或灭菌双蒸水溶解，取5?μL经1%X脂糖凝胶电泳，检查DNA质量，电泳方法参见附录D，或取适量DNA溶液用核酸定量分析仪测定，A260/A280比值为1.8～2.0，DNA浓度不低于50?ng/μL。经检测DNA质量良好后，-20?℃以下冷冻备用。

引物选择

引物设计与合成

引物宜引用已公开发表学术论文或研究报告，或在基因数据库中有哪些信誉好的足球投注网站目标物种的线粒体DNA序列自行设计2对～3对，引物宜符合Tm值50?℃～60?℃、长度18?bp～24?bp、G+C含量在40%～60%、PCR产物长度400?bp～600?bp。引物序列通过DNA序列比对工具与目的序列比对验证，检查校正无误后合成。

引物筛选

用合成的引物对样品进行预实验。按每对引物的T