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马铃薯干腐病PCR检测方法

1范围

本文件规定了马铃薯干腐病菌快速检测方法。

本文件适用于马铃薯块茎中马铃薯干腐病菌快速检测方法。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T8855新鲜水果和蔬菜取样方法

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1马铃薯干腐病Potatodryrot

马铃薯干腐病是由镰刀菌属（Fusariumspp.）真菌引起的病害。该病在马铃薯生长期和贮藏期均可发生，主要危害块茎，病斑多发生于薯块脐部。发病初期薯块表面出现黑褐色凹陷病斑，随后扩大形成较多轮纹状褶皱；后期薯块内部变空，干燥时内部长满白色菌丝，整个薯块变硬、变轻、干缩，呈灰褐色或深褐色，湿度大时发病处变红呈糊状。

4原理

本文件采用聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction，PCR）方法检测马铃薯干腐病菌。其原理是：以马铃薯干腐病菌保守序列设计特异性引物，以基因组DNA为模板，在TaqDNA聚合酶的作用下进行PCR扩增，根据PCR扩增结果判断该样品中是否含有目的片段，从而达到鉴定马铃薯干腐病菌的目的。

5试剂与材料

以下所有试剂，除另有规定外，均使用分析纯试剂；水为符合GB/T6682中规定的一级水。

5.1植物基因组的提取。

5.22×TaqPCRMasterMix。

5.3无水乙醇。

5.4溴化乙锭溶液（10mg/mL）

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称取溴化乙锭100mg，加水溶解，定容至10mL。

5.5引物缓冲液

用水将上、下游引物分别配制成工作浓度为10ng/μL的溶液。

5.650×TAE电泳缓冲液。

5.71×TAE电泳缓冲液

量取50×TAE电泳缓冲液20mL，加水定容至1L。

5.81.5%琼脂糖凝胶

称取1.5g琼脂糖，加入100mL的1×TAE电泳缓冲液，微波炉加热至琼脂糖融化，带溶液冷却至50℃左右时，加入5ul溴化乙锭溶液，摇匀，倒入制胶板中均匀铺板，凝固后取下梳子，备用。

5.92000bpDNAMarker。

5.106×DNALoadingBuffer。

6操作步骤

6.1对照的设立

检测体系以马铃薯干腐病菌的DNA作为阳性对照，以不添加DNA模板的反应体系作为阴性对照；在检测过程中要同待测样品一同进行以下操作

6.2取样及样品的制备

取马铃薯植株或块茎组织0.1g，现用现取。按照GB/T8855新鲜水果和蔬菜取样方法进行。

6.3马铃薯组织样品DNA提取

将样品置于灭过菌的研钵中，加液氮研磨成粉末，转至1.5mL离心管。后续操作参见植物基因组DNA提取试剂盒推荐步骤进行。

6.4PCR扩增

6.4.1PCR扩增引物

上游引物：5′-GACCCAAATCTAAGCTCGCC-3′下游引物：5′-GAAGGGCATGTCGCTCAAG-3′扩增片段为309bp。

6.4.2PCR反应体系

按照以下顺序加入相应试剂到PCR管中，混匀并离心10s，使混合液都沉降到PCR管底。

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表1PCR扩增反应体系

PCR反应物

体积（uL）

ddHO

9.5

2×TaqPCRMasterMix

12.5

上游引物（10ng/uL）

1.0

下游引物（10ng/uL）

1.0

模板DNA

1.0

总体积

25

6.4.3PCR反应程序

第1步：94℃,4min。

第2步：94℃,40s；61℃,40s；72℃,20s，28个循环。第3步：72℃,7min。

最后，4℃冰箱保存备用。

7琼脂糖凝胶电泳

使用1.5%的琼脂糖凝胶，按比例混匀DNALoadingBuffer和PCR扩增产物，用2000bpDNAMarker作为分子量标记，进行凝胶电泳。电泳结束后在凝胶成像仪的紫外透射光下观察，凝胶上是否出现预期大小的特异性DNA条带，并拍照记录。

8结果

8.1试验成立的条件

阳性对照检测到预期大小的特异性扩增条带，阴性对照和空白对照没有检测到预期大小的特异性扩增条带。若阳性对照、阴性对照和空白对照同时成立时，则表明试验有效，否则试验无效。

8.2结果判定

若待检样品在309bp对应位置出现特异性条带，则判定样品为阳性；若待检样品在309bp对应位置没有出现特异性条带，则判定为阴性。

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附录A（资料性）