DB2305_T 040-2024 水稻纹枯病菌分离及鉴定技术规程.docx

ICS65.020.20CCSB16

DB2305

双鸭山市地方标准

DB2305/T040—2024

水稻纹枯病菌分离及鉴定技术规程

2024-08-30发布2024-09-30实施

双鸭山市市场监督管理局发布

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前言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由双鸭山市农业农村局提出并归口。

本文件起草单位：黑龙江省农业科学院佳木斯分院、宝清县小城子镇乡村振兴发展服务中心、芜湖职业技术学院。

本文件主要起草人：杨晓贺、姚亮亮、于昌红、顾鑫、吴彦龙、高忠臣、丁俊杰、高雪冬、邱磊、张茂明、王自杰、张家智、付久才、马瑞、刘伟、王庆胜、黄成亮。

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水稻纹枯病菌分离及鉴定技术规程

1范围

本文件规定了水稻纹枯病样本的采集与保存，病原菌的分离、纯化、鉴定及保存技术要求。本文件适用于水稻纹枯病菌的分离和鉴定。

2规范性引用文件

本文件没有规范性引用文件。

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。3.1

水稻纹枯病

由立枯丝核菌侵染引起的一种水稻真菌病害，主要危害叶鞘、叶片形成云纹状病斑。田间症状见附录A。

3.2

单菌丝分离

利用真菌培养时不产生分生孢子而产生快速生长菌丝的特点，切取菌丝前端进行菌丝分离，以获得纯化菌株。

4仪器和用具

4.1常用仪器

4.1.1超净工作台

洁净等级100级@≥0.5um。平均风速0.25m/s～0.6m/s。

4.1.2高压灭菌锅

稳定范围0℃~135℃。灭菌时间范围4min～120min，最高工作压力0.22MPa～0.25MPa。4.1.3光照培养箱

稳定范围0℃~50℃。稳定波动±1℃。光照度0LX～7500LX。

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4.1.4光学显微镜

目镜10×,物镜10×、40×。

4.1.5电子天平感量0.01g。

4.1.6常用工具

剪刀、培养皿、吸水纸、接种针、试管、酒精灯、记号笔、载玻片、盖玻片、镊子，医用纱布等。

5样本采集与保存

水稻成熟期从田间剪取发病茎秆（其特征见附录B），按品种及采集地装入牛皮纸袋，贴上标签，注明采集时间、地点和水稻品种，带回实验室。放置于4℃冰箱内保存备用。

6分离技术

6.1培养基的配制

6.1.1水琼脂培养基

将20g琼脂粉加水煮沸后定容至1000mL，配制成2%水琼脂培养基。121℃湿热灭菌25min。

6.1.2马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）

将去皮马铃薯200g切成小块，加水1000mL煮沸25min，用四层纱布过滤，过滤后加入琼脂20g，再煮沸后加入葡萄糖20g，加水定容至1000mL，121℃湿热灭菌25min。

6.2病菌分离

将病组织用自来水冲洗干净，用吸水纸吸干表面水珠，将病组织剪成长宽各2mm×5mm的小块，将其放置于水琼脂平板上，每个平板放置5块病组织，置于25℃光照培养箱内培养（见附录C）。培养24h后，病组织周围即可长出具有立枯丝核菌菌落特征的菌落（见附录D），在无菌操作台内切取菌落边缘的菌丝前端，置于PDA平板上纯化。

6.3病菌的纯化单菌丝分离

将水稻纹枯病菌置于水琼脂平板上，25℃培养2d后，用切刀切取菌丝前端约1mm长度的菌丝置于水琼脂平板上，25℃培养。如此操作3次。

7菌种保存

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DB2305/T040—2024将6.3纯化的菌株转入PDA试管斜面内，25℃培养15d，放置于4℃冰箱内保存备用（见附录E）。

8病原菌的鉴定

形态学观察法。选取干净的载玻片，在载玻片上用吸管放置适量清水，挑起纯化后的病原菌的菌丝放置清水上，盖上盖玻片，利用光学显微镜显微观察。参照立枯丝核菌形态学典型特征（附录F）进行比对，确定其为水稻纹枯病菌。

9病原菌的致病性测定

将牙签剪成1cm短签，经121℃湿热灭菌30min后，将短签放置在PDA平板上，1个PDA平板内放置20个左右短牙签。将待测菌株接种至装有短牙签的PDA平板内，28℃培养7d～10d，将带有菌丝的短牙签接种至水稻叶鞘内（见附录G），接种72h后观察，出现典型水稻纹枯病症状（附