牛冠状病毒腹泻诊断技术规范.docxVIP

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牛冠状病毒腹泻诊断技术规范

1范围

本文件规定了牛冠状病毒性腹泻的临床诊断和实验室诊断技术方法、操作程序和判定标准。

本标准适用于奶牛饲养场（户）、肉牛饲养场（户）和动物诊疗单位对牛冠状病毒性腹泻的检测、诊断和检疫等。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB19489实验室生物安全通用要求

GB/T27401实验室质量控制规范动物检疫

3缩略语

下列缩略语适用于本文件。

BCoV：牛冠状病毒（Bovinecoronavirus）

CPE：致细胞病变效应（CytopathicEffect）

PBS：磷酸盐缓冲盐水（PhosphateBufferSaline）FBS：胎牛血清（FetalBovineSerum）

PCR：聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction）

TCID50：半数细胞培养物感染量（MedianTissueCultureInfectiveDose）LD50：半数致死量（MedianLethalDose）

MA104细胞：恒河猴肾细胞（Rhesuskidneycell）Vero细胞：非洲绿猴肾细胞（VerdaRenoCell）

MDBK细胞：牛肾细胞（MadinDarbyBovineKidneyCell）DMEM：DuLbecco’sModifiedEagleMedium

4生物安全措施

样品采集的生物安全措施符合GB/T27401的规定。样品处理的生物安全措施符合GB19489的规定。

5病原

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牛冠状病毒属冠状病毒科，乙型冠状病毒属，病毒颗粒为球状，直径75～220nm，具有囊膜和棒状纤突，核衣壳螺旋状对称。基因组为单分子线状正链单股RNA。

6临床诊断

6.1流行病学

6.1.1传染源

病牛是本病自然流行的主要传染源，犊牛一旦感染，可在48h内排出大量病毒粒子。6.1.2传播途径

经粪-口、呼吸道及机械性传播。

6.1.3易感动物

7日龄的犊牛易感，也可发生在出生24h内没有摄取初乳的犊牛。成年牛可急性发病，产后奶牛易发。

6.1.4流行特点

冬春季节感染最为严重，常和母牛分娩期接近，腹泻通常在同一牛场连续发生。

6.2临床症状

犊牛感染后发生腹泻，发病初期出现带血的黄色黏性粪便，后期发展为水泻，有时出现脱水、虚弱、体温低，少数犊牛出现发热、卧地不起等症状，严重的犊牛会出现昏迷甚至死亡。成年牛常突然暴发，排出深褐色带血稀粪，伴有产奶下降、沉郁及厌食等症状。

6.3病理变化

小肠肠壁变薄、透明，肠腔液体增多，严重者引起腹腔积水，胃内有未消化的凝乳块。牛冠状病毒感染的牛可能伴随呼吸道症状，表现为气管黏膜充血、局限性肺炎等。

6.4结果判定

易感动物出现上述临床症状和病理变化，可初步判定为牛冠状病毒性腹泻疑似病例。

7实验室诊断

7.1器材

7.1.1CO2细胞培养箱

7.1.2T25细胞培养瓶

7.1.3漩涡振荡器

7.1.4倒置显微镜

7.1.5电镜

7.1.6电泳仪

7.1.7水平电泳槽

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7.1.8凝胶成像仪

7.1.9不同规格可调移液器与枪头

7.1.10PCR仪

7.1.11台式高速离心机

7.1.12低速离心机

7.1.13水浴锅

7.1.14电子天平

7.1.1596孔细胞培养板

7.1.16无菌棉拭子

7.1.17玻璃珠

7.1.18不同规格离心管

7.1.19PCR管

7.1.20无菌密封袋

7.1.21手术刀

7.1.22手术剪

7.1.23无菌镊

7.1.24研钵

7.2试剂

7.2.1PBS

7.2.2DMEM培养基

7.2.3细胞培养液

7.2.4细胞维持液

7.2.5FBS

7.2.60.25%EDTA-胰酶

7.2.7HRT-18细胞

7.2.8青链霉素

7.2.9丙酮

7.2.102%磷钨酸

7.2.11无酶水

7.2.12PCRTaq酶

7.2.13电泳缓冲液

7.2.14琼脂糖

7.2.15DNAMarker

7.3样品采集与处理

7.3.1粪便样品

将棉拭子伸入肛门内刮取新鲜粪便，地上有刚排出新鲜粪便时无菌采集。分别放入装有3mLPBS的管中，编号并记录相关信息。

漩涡振荡器充分振荡，4℃