乳酸菌的耐药检测方案.pdfVIP

试验方案:

一、样品的取样

在青岛胶州市的正规超市购买5种酸奶,进行实验时均处于产品保质期内。对

这几种样品分别进行取样。

二、样品的稀释

在无菌工作台上用灭菌过的移液管直接从酸奶样品中吸取1mL装入9ml无菌

生理盐水试管中,快速震荡试管,,使其呈1:10的均匀稀释液,同法继续稀释成10-

2、10-3、10-4、10-5、10-6稀释度,选取合适的三个稀释度(如:10-1、10-2、10-

3)按此操作依次制备成A1-A2-A3、B1-B2-B3、C1-C2-C3、D1-D2-D3、E1-E2-E3的

样品稀释液。

三、样品的分离鉴定

1、分别用移液枪吸取A-E的样品稀释液250μL置于MRS固体培养基(MRS培

养基成分:蛋白胨10g,牛肉膏10g,酵母粉5g,K2HPO42g,柠檬酸二铵2g,乙酸钠5g,

葡萄糖20g,吐温801mL,MgSO4·7H2O0.58g,MnSO4·4H2O0.25g,(琼脂15~20g),

蒸馏水1000mL)平板上,涂布均匀后置于37℃培养箱培养24h,观察培养结果及细菌

的生长情况。用接种环在各平板上挑取出现不同菌落形态大小的单一黄色菌落,分

别在平板上划线,37℃倒置培养24h。

2、根据菌落的大小、颜色、光泽和透明程度等,从培养24h的每个平板中选

取单菌落,在MRS固体平板上反复划线纯化,反复进行此操作步骤以使最终培养出的

每个菌落都为单一菌种菌落,37℃培养24h。然后依次进行菌体形态观察、过氧化

氢酶试验、淀粉水解试验、明胶液化试验、乙酰甲基甲醇试验、产气试验、碳水化

合物发酵试验、乳酸定性检测。

(1)菌体形态的观察

将划线平板上培养了24h的各菌株在载玻片上涂片及固定后,进行革兰氏染

色。先用草酸铵结晶紫初染色,1分钟后水洗载玻片,然后碘液媒染1分钟,水洗、

吸干。95%乙醇脱色直到滴加的酒精不出现紫色,接着水洗、吸干。最后用0.5%的

番红染色液再染色10-30秒,水洗,干燥,置于光学显微镜下观察其形态特点及染色

结果。选取油镜观察细胞呈杆状或球状,革兰氏阳性菌。

(2)过氧化氢酶测定实验

取一环接种的培养物,涂于干净的载玻片上,然后在其上滴加过氧化氢,有气泡

则为阳性反应,无气泡为阴性反应。

(3)淀粉水解试验

将固体淀粉培养基融化后冷却至50℃左右,无菌操作制成5个平板,将划线平

板上培养了24h的各菌株分别在不同平板上划线接种。将平板倒置37℃恒温箱中

培养24h。观察各种菌的生长状况,打开平板盖子,滴入少量卢戈氏碘液于平板中,

轻轻旋转平板,使碘液均匀铺满整个平板。

如菌苔周围出现无色透明圈,说明淀粉已被水解,为阳性。透明圈大小可初步

判断该菌水解淀粉能力的强弱,即产生细胞外淀粉酶活力的高低。

需要的试剂:H2SO4、HCl、MRS固体培养基(蛋白胨10g,牛肉膏10g,酵母粉5g,

K2HPO42g,柠檬酸二铵2g,乙酸钠5g,葡萄糖20g,吐温801mL,

MgSO4?7H2O0.58g,MnSO4?4H2O0.25g,(琼脂15~20g),蒸馏水1000mL)卢戈氏碘

液(碘5g碘化钾10g蒸馏水加至100ml)

需要的仪器:恒温箱

(4)明胶液化试验

将被检菌穿刺接种于明胶培养基,于22℃培养7d,逐日观察结果。若用35℃

孵育,因明胶在此温度下自行液化,故在观察结果前,先置4℃冰箱内30min,再看结

果。

结果:培养基呈液化状态为阳性。

需要的试剂:明胶培养基(NaCl5g,蛋白胨10g,牛肉膏3g,明胶120g,蒸馏水

1000mL在水浴锅中将上述成分溶化,不断搅拌。溶化后调pH7.2~7.4,

121°C灭菌30min。)

需要的仪器:电磁炉恒温箱

(5)乙酰甲基甲醇试验

用接种针将划线平板上培养了24h的各菌株分别穿刺接入5支葡萄糖蛋白胨

水培养基中,置37℃培养58h。在试管培养液中直接加入10~20滴的40%KOH和