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悬浮后，红细胞膜蛋白定量，用考马斯亮蓝法三、材料、试
剂与器具
（一）试剂
1、染色液：取考马斯亮蓝G-250（红褐色）100mg溶于
50ml95%乙醇中，加100ml85%磷酸，加水稀释至1升。该
染色液可保存数月，若不加水可长期保存，用前稀释。
2、标准蛋白溶液：0.5mg/ml牛血清白蛋白。
3、未知浓度的蛋白质溶液用酪蛋白配制，浓度控制在10
—30mg/ml
（二）器具
1、试管及试管架
2、移液管（1ml,5ml）
3、可见光分光光度计
四、操作步骤
（一）标准曲线的制作
1、取7支试管，按下表加入试剂
试
管编号0123456
试剂(ml)
1mg/ml牛血清
00.10.20.40.60.81
蛋白
蒸馏水10.90.80.60.40.20
考马斯亮蓝试
5555555
剂
2、将试管摇匀，放置20分钟。
3、用分光光度计比色测定吸光值A。
595nm
4、以A为纵坐标，标准蛋白色质浓度为横坐标，绘制
595nm
标准曲线。
（二）样品的测定
1、取一支试管，加入未知浓度的蛋白质溶液0.2ml，蒸
馏水0.8ml考马斯亮蓝试剂5ml.
2、将试管摇匀，放置20分钟。
3、比色测定吸光值A，对照标准曲线求得蛋白质的浓
595nm
度。
调整蛋白浓度为200~800ug/ml
荧光偏振法
DPH溶液：将0.464mgDPH溶于1ml四氢呋喃中配制储备液，
浓度为2×10^-3mol/l，剧烈振摇3~5min,f放在棕色瓶中，
避光保存于-20℃冰箱。临用前从冰箱取出，在室温下融化，
每次试验前再用PBS(0.01mmol/l，ph=7.4)）稀释成2×
10^-6mol/l的工作液。稀释时必须猛烈摇晃2~3min,
红细胞膜的荧光标记：将洗净的红细胞与2×10^-6mol/lDPH
在25℃条件下温育30分钟。加入肝素抗凝的新鲜血液
3000r/min离心5min,加PBS缓冲液,洗涤三次，去除上清在
红细胞沉淀中加入8ml的10mmol/lph=7.4的HCL溶液，同
时加入适量的蛋白酶抑制剂对甲苯磺酰氟，4℃溶血过夜，
使红细胞膜破膜，使红细胞溶液以1200r/min，4℃离心30min,
弃上清液，10mmol/lPH=7.4Tris-HCL溶液同样转数离心洗
涤三次，辞去白色沉淀物，最后1:1悬浮在等体积的ph=7.4
的PBS溶液中。用考马斯亮蓝法
得到红细胞膜影泡，(dph做荧光探针)取新配制的2mmol/l
的DPH四氢呋喃液1ml,分别加入200ul红细胞膜影泡悬液及
2mlPBS缓冲液，快速混匀配置，在37℃下水浴30min，
3000r/min，离心10min,弃去残留DPH标记液，用等渗PBS
（磷酸盐缓冲液）洗两遍，再用等渗PBS缓冲液稀释成4ml
细胞悬液。
在石英杯中用荧光分光光度仪检测荧光偏振度荧光偏振法
测定：
测定参数：激发波长（EX）362nm，发射波长（EM）432nm,
激发
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