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免疫组化常见问题及其解决办法

1、一抗从4度拿出后，为什么要进行37度复温？

（1）一方面，防止切片从4度直接放入PBS易脱片；

（2）另一方面，使抗原抗体结合更稳定。一般不需要，但对表达较

弱的抗原可能有用，4度和37度时分子运动方式不同，前者分子碰

撞机率和运动速度小于后者，后者结合更快，但敏感性也提高了并

易造成非特异染色。

（3）其实，我更赞同后一种说法，由于我尝试把肝脏或睾丸片子从

4度过夜拿出后，直接用PBS洗没发生过脱片现象。

2、切片染色后背景太深，如何区分特异性与非特异性着色？

全片着色是指整个切片全都染上了颜色，着色的强度可深可浅，总

之，分不清那些组织是阳性那些组织是阴性。消失这种现象的缘由

有：

（1）抗体浓度过高：一抗浓度过高是常见的缘由之一。解决方法是，

每次使用新抗体前应当对其工作浓度进行测试，使每一抗体个体化，

找到适合自己试验室的抱负工作浓度，既使是即用型的抗体也应如

此，不能只简洁的按说明书进行染色。

（2）抗体孵育时间过长或温度较高：解决方法是，严格执行操作规

程，最好随身佩带报时表或报时钟，准时提示，避开因遗忘而造成

时间延长。现在流行的二步法（Polymer）敏感性很高，要求一抗孵

育的时间不是传统的1小时，而是30分钟，因此，要依据染色结果

进行调整。

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（3）DAB变质和显色时间太长：DAB最好现用现配，如有沉渣应进

行过滤后再用。配制好的DAB不应存放时间太长，由于在没有酶的

状况下，过氧化氢也会游离出氧原子与DAB产生反应而降低DAB的

效力，未用完的DAB存放在冰箱里几天后再用这种好像节省的方法

是不行取的。DAB的显色最好在显微镜下监控，达到抱负的染色程

度时马上终止反应。不过当染色片太多时或用染色机时，这样做好

像不现实，但至少应对一些新的或少用的抗体显色时进行监控，避

开显色时间过长。

（4）组织变干：修复液溢出后未准时补充液体、染色切片太多、动

作太慢、遗忘滴液、滴液流失等都是造成组织变干的缘由。解决的

方法是操作要仔细认真，采纳DAKO笔或PAPPen在组织四周画圈，

可以有效的避开液体流失，也能提高操作速度。

（5）切片在缓冲液或修复液中浸泡时间太长（大于24小时）：缘

由上不清晰，但现象存在。有的试验室喜爱前一天将切片脱蜡至修

复，其次天加抗体进行免疫组化染色，假如将装有切片和修复液的

容器放在4oC冰箱过夜，对结果无明显影响，假如放在室温，特殊

是酷热的夏天，会消失背景着色，因此，不行存放时间太长。

（6）一抗变质、质量差的多克隆抗体：留意抗体的有效期，过期的

抗体要麽不显色要麽背景着色。用新买的抗体时最好设立阳性对比

和用使用过的抗体作比较。

3、脱片产生的缘由有哪些？

（1）多聚赖氨酸玻片质量的问题。我原先是买的，迈新按说也是不

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错的，可是都脱成什么样子了。后面补做其次批时用的病理科老师

自己做的片子，要好一点。

（2）组织切的不好，切片机的问题例如比较老的旧的机器切的厚或

者不匀称，或者切片者手法不好等。

（3）没烤好，时间短，温度不够之类。

（4）操作的时候甩的太猛了，有脱片嫌疑的片子最好不甩或轻轻甩，

用卫生纸从边缘上渐渐吸水。

（5）修复的问题：抗原修复的时候高压时间过长了，或者放进100

度的修复液时手法不好，咚的一声就丢进去了，这样超简单脱片。

此外，用EDTA修复比柠檬酸简单脱片，但是你要用到EDTA的时候

也没方法，只有从另外的问题上着手。

（6）一旦见到有组织漂起来操作就更加要谨慎，用PBS的时候尽量

用泡的，不要冲。基本上把这些方面都留意到了，能改善的尽量改

善，脱片可以削减许多。

（7）组织的问题，我用的组织癌症的许多，越是癌症组织有坏死之

类越简单脱。

4、免疫组化中抗原修复的最佳条件是什么？（尤其是微波修复）

关于抗原修复，我试过的修复条件有EDTA热修复，柠檬酸钠为缓冲

液的微波修复以及高压锅修复。从我的试验结果来看，微波修复其

实很不简单掉片子的，而EDTA热修复和高压锅修复是很简单掉片子

的。由于掉片子主要是由于加热过程中产生的气泡所引起，而微波

修复水加热到沸腾，沾在片子上的气泡就会少，不会由于小气泡上

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串引起