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过氧化氢酶活力的测定实验报告

篇一：实验35过氧化氢酶的活性测定

植物在逆境下或衰老时，由于体内活性氧代谢加强而使

h2o2发生累积。h2o2可以直接或间接地氧化细胞内核酸，

蛋白质等生物大分子，并使细胞膜遭受损害，从而加速细胞

的衰老和解体。过氧化氢酶可以清除h2o2，是植物体内重要

的酶促防御系统之一。因此，植物组织中h2o2含量和过氧

化氢酶活性与植物的抗逆性密切相关。本实验用分光光度法

测定过氧化氢含量，利用高锰酸钾滴定法和紫外吸收法测定

过氧化氢酶活性。

一、过氧化氢含量的测定

【原理】

h2o2与硫酸钛（或氯化钛）生成过氧化物—钛复合物黄

色沉淀，可被h２so4溶解后，在415nm波长下比色测定。

在一定范围内，其颜色深浅与h2o2浓度呈线性关系。

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【仪器和用具】

研钵；移液管0.2ml×2支，5ml×1支；容量瓶10ml×

7个，离心管5ml×8支；离心机；分光光度计。

【试剂】

100μmol/Lh2o2丙酮试剂：取30%分析纯h2o257μl，

溶于100ml，再稀释100倍；2mol/L硫酸；5%（w/V）硫酸

钛；丙酮；浓氨水。【方法】

1.制作标准曲线：取10ml离心管7支，顺序编号，并

按表40-1加入试剂。

待沉淀完全溶解后，将其小心转入10ml容量瓶中，并

用蒸馏水少量多次冲洗离心管，将洗涤液合并后定容至10ml

刻度，415nm波长下比色。

2.样品提取和测定：(1)称取新鲜植物组织2~5g（视h2o2

含量多少而定），按材料与提取剂1∶1的比例加入4℃下预

冷的丙酮和少许石英砂研磨成匀浆后，转入离心管

3000r/min下离心10min，弃去残渣，上清液即为样品提取

液。(2)用移液管吸取样品提取液1ml，按表35-1加入5%硫

酸钛和浓氨水，待沉淀形成后3000rpm/min离心10min，弃

去上清液。沉淀用丙酮反复洗涤3～5次，直到去除植物色

素。(3)向洗涤后的沉淀中加入2mol硫酸5ml，待完全溶解

后，与标准曲线同样的方法定容并比色。3.结果计算：

植物组织中h2o2含量(μmol/gFw)=

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式中c—标准曲线上查得样品中h2o2浓度（μmol）；Vt

—样品提取液总体积（ml）；V1—测定时用样品提取液体积

（ml）；Fw—植物组织鲜重（g）。

二、过氧化氢酶的活性测定——高锰酸钾滴定法

【原理】

过氧化氢酶（cAT）属于血红蛋白酶，含有铁，它能催

化过氧化氢分解为水和分子氧，在此过程中起传递电子的作

用，过氧化氢则既是氧化剂又是还原剂。

R(Fe+2)+h2o2==R(Fe+3+oh－)

R(Fe+3oh－)2+h2o2==R(Fe+2)2+2h2o+o2

据此，可根据h2o2的消耗量或o2的生成量测定该酶活

力大小。在反应系统中加入一定量（反应过量）的h2o2溶

液，经酶促反应后，用标准高锰酸钾溶液（在酸性条件下）

滴定多余的h2o2

5h2o2+2Kmno4+4h2so4

5o2+2Khso4+8h2o+2mnso4

即可求出消耗的h2o2的量。【仪器和用具】

研钵；三角瓶50ml×4；酸式滴定管（10ml）；恒温水浴；

容量瓶25ml×1。【试剂】

10%h2so4；0.2mol/L磷酸缓冲液ph7.8；

0.1mol/L高锰酸钾标准液：称取Kmno4（AR）3.1605g，

用新煮沸冷却蒸馏水配制成1000ml，用0.1mol/L草酸溶液