西甜瓜病毒鉴定技术规程.docx

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甜瓜病毒鉴定技术规程

1范围

本文件规定了甜瓜病毒鉴定中的术语与定义、检测对象、抽样、取样部位、鉴定方法和判定规则等内容。

本文件适用于内蒙古侵染甜瓜的病毒种类的鉴定。2规范性引用文件

本文件没有规范性引用文件。

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

甜瓜Cucumismelo

葫芦科黄瓜属一年蔓生草本植物。

3.2

逆转录-聚合酶链式反应Reversetranscription-polymerasechainreaction（RT-PCR）聚合酶链式反应Polymerasechainreaction（PCR）

提取甜瓜样品的总RNA（总DNA），对于RNA病毒，以其中的mRNA为模板，利用逆转录酶反转录合成cDNA，再以cDNA为模板使用侵染甜瓜的病毒特异性引物进行聚合酶链式反应；对于DNA病毒，以总DNA稀释液（按浓度比例稀释）为模板使用侵染甜瓜的病毒特异性引物进行聚合酶链式反应。

4检测对象

主要鉴定病毒种类：

1)瓜类蚜虫传黄化病毒（Cucurbitaphid-borneyellowsvirus，CABYV）

2)瓜类褪绿黄化病毒（Cucurbitchloroticyellowsvirus，CCYV）

3)黄瓜绿斑驳花叶病毒（Cucumbergreenmottlemosaicvirus，CGMMV）

4)黄瓜花叶病毒（Cucumbermosaicvirus，CMV）

5)瓜类黄色矮化失调病毒（Cucurbityellowstuntingdisordervirus，CYSDV）

6)甜瓜蚜传黄化病毒（Melonaphid-borneyellowsvirus，MABYV）

7)甜瓜坏死斑点病毒（Melonnecroticspotvirus，MNSV）

8)甜瓜黄斑病毒（Melonyellowspotvirus，MYSV）

9)番木瓜环斑病毒（Papayaringspotvirus，PRSV）

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10)南瓜花叶病毒（Squashmosaicvirus，SqMV）

11)烟草花叶病毒（Tobaccomosaicvirus，TMV）

12)烟草坏死病毒（Tobacconecrosisvirus，TNV）

13)番茄环斑病毒（TomatoRingspotVirus，ToRSV）

14)西瓜花叶病毒（Watermelonmosaicvirus，WMV）

15)西瓜银斑驳病毒（Watermelonsilvermottlevirus，WSMoV）

16)小西葫芦黄花叶病毒（Zucchiniyellowmosaicvirus，ZYMV）

17)中国南瓜曲叶病毒（Squashleafcurlchinavirus，SLCCNV）确定依据：参考国内外甜瓜病毒研究相关论文确定。

5抽样

采用5点取样法随机抽取。1000株以内抽检10株(含1000株)；1000株～10000株(含10000株),首个100株抽100株，之后每增加1000株增检5株，不足1000株按1000株计；超过10000株，第1000~10000株按上述方法抽样，之后每增加1000株增检20株，不足1000株按1000株计。

6取样部位

疑似病毒病感染的甜瓜植株，症状如斑驳黄化、邹叶卷曲、瓜果畸形等。取甜瓜植株叶片放置于自封袋内，4℃保存不超过24h或液氮预冷后立即放置于-80℃长期保存备用，其成熟果实保留种子备用。

7鉴定方法

7.1逆转录聚合酶链式反应法（RT-PCR法）、聚合酶链式反应法（PCR法）

7.1.1试剂盒

RNA提取试剂盒(DNA提取试剂盒)：选择适合提取含有多糖多酚材料的RNA（DNA）试剂盒。反转录试剂盒：使用市售的商品反转录试剂盒，按照说明进行操作。

PCR扩增试剂盒：使用市售的商品PCR扩增试剂盒，按照说明进行操作。

7.1.2引物

侵染甜瓜的病毒特异性检测引物（如表1）。

表1已报道的侵染甜瓜的病毒特异性检测引物

病毒

引物名称

引物序列（5’→3’）

目标片段（bp）

Virus

Primername

Primersequence

Targetfragment

CABYV

CCYV

CGMMV

CABYV-F

CABYV-R

CCYV-F

CCYV-R

CGMMV-F

GAYTGCTCYGGYTTYGACTGGAG

GATYTTATAYTCATGGTAGGCCTTGAG