DNA提取方法和试剂作用.pdfVIP

1试剂的作用氯仿的作用？氯仿：克制酚的缺点；加速有机相与液相

分层。最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的迹量酚。〔酚易溶于氯仿

中)用酚-氯仿抽提细胞基因组DNA时，通常要在酚-氯仿中加少许异

戊醇，为什么？异戊醇：减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。

异戊醇可以降低外表张力，从而减少气泡产生。另外，异戊醇有助

于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层

有机溶剂相维持稳定。用乙醇沉淀DNA时，为什么参加单价的阳离

子？用乙醇沉淀DNA时，通常要在溶液中参加单价的阳离子，如

NaCI或NaAc,Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间

的同性电荷相斥力，而易于聚集沉淀。

2DNA提取分为三个根本步骤每个步骤的具体方法可根据样品种类、

影响提取的物质以及后续步骤的不同而有区别。

.细胞的破碎细菌有坚硬的细胞壁，首先要破碎经胞。方法有三种;①机械方法：超

声波处理法、研磨法、匀浆法;②化学试剂法：用SDS处理细胞;③酶解法：参加

溶菌酶或蜗牛醇，都可使细胞壁破碎。

利用研磨或者超声破碎细胞，并通过参加去污剂以除掉膜脂。

参加蛋白酶，醋酸盐沉淀，或者酚/氯仿抽提，以除掉细胞内的蛋白，如与DNA结

合的组蛋白。将DNA在冷乙醇或异丙醇中沉淀，因为DNA在醇中不可溶而黏在一

起，这一步也能除掉盐分。另外，目前也有利用吸附过柱的方法提取DNA的商业化

试剂盒。

DNA提取的几种方法(1).浓盐法

A.利用RNA和DNA在电解溶液中溶解度不同，将二者别离，常用的方法是用1M

氯纳抽提,得到的DNA粘液与含有少量蛋白质氯仿一起摇荡,使乳化，再离心除去

蛋白质，此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间，而DNA位于上层水相中，用

2倍体积95%乙醇可将DNA钠盐沉淀出来.

B.也可用0.15MNaCL液反复洗涤细胞破碎液除去RNA,再以lMNaCL提取脱氧核

糖蛋白，再按氯仿…异醇法除去蛋白.

两种方法比较，后种方法使核酸降解可能少一些.

C.以稀盐酸溶液提取DNA时，参加适量去污剂，如SDS可有助于蛋白质与DNA

的别离。在提取过程中为抑制组织中的DNase对DNA的降解作用，在氯化钠溶液

中参加柠檬酸钠作为金属离了的烙合剂.通常用.15MNaCL,0.015M柠檬钠，并称

)

SSC溶液，提取DNA.〔2.阴离子去污剂法；用SDS或二甲苯酸钠等去污剂使蛋

白质变性,可以直接从生物材料中提取DNA.由于细胞中DNA」J蛋白质之间常借静

电引力或配位键结合，因为阴离子去污剂能够破坏这种价键，所以常用阴离子去污

剂提取DNA

⑶.苯酚抽提法：苯酚作为蛋白变性剂，同时抑制了DNase的降解作用.用苯酚

处理匀浆液时，由于蛋白与DNA联结键己断,蛋白分子外表又含有很多极性基团与

苯酚相似相溶。蛋白分了溶于酚相，而DNA溶于水相。离心分层后取出水层,屡次

重复操作，再合并含DNA的水相，利用核酸不溶于醇的性质，用乙醇沉淀10%SDS

（变性剂破细胞壁）100ml

配制方法：

将10g的十二烷基硫酸钠（SDS）溶解于80ml双蒸水于68°C加热溶解，用浓HCI调至

PH=7.2,定容至100ml,摇匀后，转到准备好的输液瓶中，贴上标签，4C保存备用。

5.蛋白酶K（降解蛋白质）：20mg/mL无菌三蒸水溶解。

6.RNAiW（降解RNA）配制方法：

将胰RNA酶〔RNA酶A）溶于10mmol/L的Tris・CL〔PH7.5）、15mmol/LNaCL中,配成

10mg/ml的浓度，于100C加热15min,缓慢冷却至室温，分装成小份存于-20°C。

7.氯仿：异戊醇=24：1100ml按24:1的比例参加氯仿、异戊醇，摇匀，转到准备好的瓶中，

贴上标签，4°C保存备用。

8.TE缓冲液〔溶解DNA）PH8.050ml配制方法：