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二、氧化氢酶的活性测定--高锰酸钾滴定法

[原理]

过氧化氢酶属于血红蛋白酶，含有铁，它能催化过氧化氢分解为水和分子氧，在此过程中

起传递电子的作用，过氧化氢则既是氧化剂又是还原剂。据此，可根据H202的消耗量或

O2的生成量测定该酶活力大小。在反应系统中加入一定量(反应过量)的H2O2溶液，经过

酶促反应后，用标准高锰酸钾溶液(在酸性条件下)滴定多余的H2O2

5H2O2+2KMnO4+4H2SO45O2+2KHSO4+8H2O+2MnSO4

[仪器和用具]

研钵；三角瓶50ml4个；10ml酸式滴定管；恒温水浴锅；容量瓶25ml1个。

[试剂]

10％H2SO4；0．2mol?L-1磷酸缓冲液pH7.8;0．1mol?L-1高锰酸钾标准液；称取

KmnO4(AR)3.160克，用新煮沸泠却的蒸馏水配制成1000ml,用0.1moL.L-1草酸溶液标定；

0.1mol.l-1H2O2：市售30％H202大约等于17．6m01?L-1，取30％H202溶液5．68ml,稀释

至于1000ml,用标准0.1molKMnO4溶液（在酸性条件下）进行标定0.1mol.L-1草酸：称取

优级纯H2C2O4.2H2O12.607g,用蒸馏水溶解后，定容至1L。

[方法]

1．酶液提取：取小麦叶片2．5g加入pH7.8的磷酸缓冲溶液少量，研磨成匀浆，转移至25ml

容量瓶中，用该缓冲液冲洗研钵，并将冲洗液转入容量瓶中，用同一缓冲液定容，4000r?min-1

离心15min,上清液即为过氧化氢酶的粗提液。

2．取50ml三角瓶4个(2个测定，2个对照)，测定瓶中加入酶液2.5ml，对照瓶中加入

煮死酶液2.5ml，再加入2.5ml0.1mol01?L-1H202，同时计时，于30℃恒温水浴中保温10min，

立即加入10％H2S042.5ml

3．用0.1mol?L-1KMnO4标准溶液滴定H202，至出现粉红色(在30min内不消失)为终

点。

4．结果计算：酶活性用每克鲜重样品1min内分解H202的毫克数表示：酶活

（mg.g-1.min-1）=

式中A--对照KMn04滴定毫升数(ml)

B酶反应后KMnO4滴定毫升数（ml）

VT酶液总量（ml）;

V1反应所用酶液量（ml）

W样品鲜重（g）1.71ml0.1mol.L-1的KMnO4相当于1.7mgH2O2.

注意所用KMnO4溶液及H2O2溶液临用前要经过重新标定。

三、过氧化氢酶的活性紫外吸收法

[原理]

H202在240nm波长下有强吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶液吸光度（A240）

随反应时间而降低。根据测量吸光的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。

[仪器与用具]紫外分光光度计；离心机；研钵；容量瓶250ml1个；刻度吸管0.5ml2支；2ml1

支；10ml试管3支；恒温水浴锅。

[试剂]

0.2mol?L-1pH7．8磷酸缓冲液(内含1％聚乙烯吡咯烷酮)；0．1mol?L-1H202(用0．1mol?L-1

高锰酸钾标定)。

[方法]

1．酶液提取称取新鲜小麦叶片或其他植物组织0．5g，置研钵中，加入2-3ml4℃下

预冷的pH7.0磷酸缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后，转入25ml容量瓶中，并用缓冲液冲

洗研钵数次，合并冲洗液，并定容到刻度。混合均匀，将量瓶置5℃冰箱中静置10min，取

上部澄清液在4000r.min-1下离心15min，上清液即为过氧化氢酶粗提液，5℃下保存备用。

2．测定取10ml试管3支，其中2支为样品测定管，1支为空白管，按表42-2顺序加

入试剂。25℃预热后,逐管加入0.3ml0.1mol的H2O2，每加完1管立即记时，并迅速倒入

石英比色杯，240nm下测定吸光度，每隔1min读数1次，共测4min，待3支管全部测定完

后，按式42-3计算酶活性。

3．结果计算以1min内A240减少0．1的酶量为1个酶活单位