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人牙龈上皮细胞的原代和传代培养

人牙龈上皮细胞的原代和传代培养*

潘宣1周健1曾融生2

1广州铁路(集团)公司广州铁路中心医院口腔科(510080);2中

山大学光华口腔医学院(广州510060)

广东医学2003年11月第24卷第11期

1材料与方法

111细胞分离与原代培养拟行阻生牙拔除术患者,术

前检查排除系统性疾病,无口腔黏膜疾病,冠周龈组织无

炎症表现,术前征得患者同意,术中无菌状态下切取颊侧

或远中龈组织一块,约3mm@5mm,在手术显微镜下尽

可能去除黏膜下结缔组织,放入盛有无血清DMEM培养

液(美国Gibco公司)的青霉素小瓶,置于低温保温瓶中尽快带回

实验室。在实验室超净工作台内取出组织块,PBS

漂洗3次,除去血凝块,放入含青霉素100u/ml、链霉素

100u/ml的无血清培养液中浸泡漂洗10min;含10%氟

康唑无血清DMEM培养液冲洗3次,剪成1mm@1mm小

块后置于消毒的青霉素小瓶中,加入1ml0125%分离酶

(dispase,美国Gibco公司),密封置于4e冰箱,16h后取

出。在实验室超净工作台内取出组织块,在解剖显微镜

下使用两把眼科镊把上皮组织与其下的结缔组织完全分

离,无血清DMEM培养液轻轻冲洗上皮组织块3次,置于

消毒的5ml离心管,加入01125%胰酶(上海生工公司)1

ml,37e,轻轻震荡2min后,加含10%胎牛血清(FCS,美

国HYCLONE公司)的培养液2ml终止胰酶消化,吹管轻

轻吹打至形成单细胞悬液。转数800r/min离心3min,

弃上液,加培养液,倒置显微镜下计数,调整细胞浓度为

1@106/ml,接种于培养瓶中。于37e,湿度100%,5%CO2,95%

空气的培养箱(美国SHEL-LAB公司)中培养,

每2天换液一次。每天倒置显微镜(日本OLYMPUS公

司)下观察。培养液中主要添加成分及比例为FCS,

10%;penicillinG,100u/ml;kanamycin,011mg/ml;

hydrocortisone,

015Lg/ml;insulin,5Lg/ml;amphotericinB,0125

Lg/ml。

112龈上皮细胞的传代培养原代培养细胞在7~10d

左右开始生长融合成片,当细胞汇合达80%左右时,吸出

原含有FCS的培养液,加入少量0125%胰蛋白酶,轻轻震

荡10s以中和残余的FCS,弃去,再加入0125%胰蛋白酶

1ml,37e,在倒置显微镜下控制消化时间,待上皮细胞

收缩变圆时加入含10%FCS的培养液终止消化,吸管吹

打至细胞脱落,形成细胞悬液。按1B2比例传代培养。

113原代培养细胞的鉴定在培养皿中置入消毒的盖

玻片,同前方法,细胞分离制成细胞悬液后调整细胞浓度

为5@106/ml,接种于消毒的盖玻片表面,静置24h后,加

入培养液,培养箱中培养。在培养后第10天,取出生长

有上皮细胞的盖玻片,PBS液冲洗3次后,空气干燥,丙

酮固定,A