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9种层析分离纯化方法详解

层析法是利用不同物质理化性质的差异而建立起来的技术。所有的层析系统

都由两个相组成：一是固定相，它或者是固体物质或者是固定于固体物质上的成

分；另一是流动相，即可以流动的物质，如水和各种溶媒。当待分离的混合物随

溶媒（流动相）通过固定相时，由于各组份的理化性质存在差异，与两相发生相

互作用（吸附、溶解、结合等）的能力不同，在两相中的分配（含量对比）不同，

而且随溶媒向前移动，各组份不断地在两相中进行再分配。与固定相相互作用力

越弱的组份，随流动相移动时受到的阻滞作用小，向前移动的速度快。反之，与

固定相相互作用越强的组份，向前移动速度越慢。分部收集流出液，可得到样品

中所含的各单一组份，从而达到将各组份分离的目的。按层析原理可将层析分为

以下9种：

1、亲和层析

利用待分离物质和它的特异性配体间具有特异的亲和力，从而达到分离的目

的。将可亲和的一对分子中的一方以共价键形式与不溶性载体相连作为固定相吸

附剂，当含混合组分的样品通过此固定相时，只有和固定相分子有特异亲和力的

物质，才能被固定相吸附结合，性无关组分随流动相流出。改变流动相组分，可

将结合的亲和物洗脱下来。亲和层析中所用的载体称为基质，与基质共价连接的

化合物称配基。具有专一亲和力的生物分子对主要有：抗原与抗体，DNA与互

补DNA或RNA，酶与底物、激素与受体、维生素与特异结合蛋白、糖蛋白与植

物凝集素等。亲和层析可用于纯化生物大分子、稀释液的浓缩、不稳定蛋白质的

贮藏、分离核酸等。

亲和层析纯化的分离原理

特点：亲和层析具有高选择性、高纯度、快速、浓缩等特点，在重组蛋白的

分离中多作为第一步的粗纯，实现对绝大部分杂质蛋白的去除。

2、离子交换层析

采用具有离子交换性能的物质作固定相，利用它与流动相中的离子能进行可

逆交换的性质来分离离子型化合物的方法。主要用于分离氨基酸、多肽及蛋白质，

也可用于分离核酸、核苷酸及其他带电荷的生物分子。不同蛋白质的等电点（pI，

isoelectricpoint）特性，使在不同pH缓冲液条件下所带正/负净电荷不同，选择

不同的离子交换柱实现分离。

离子交换层析纯化的分离原理

特点：离子交换层析属于吸附性分离方式，纯化过程中它具有可逆、操控性

强及实现样品浓缩等特点。在精纯实验中是常与其它方法相结合使用的主要技术。

3、凝胶过滤层析

又称分子筛过滤或排阻层析等，根据大小和形状分离，这种分离方式是非吸

附性的，整个分离过程中只需要一种缓冲液，实验操作方便医学教育网搜集整理

固定相是多孔凝胶，各组分的分子大小不同，因而在凝胶上受阻滞的程度也不同。

本法的优点是所用凝胶属于惰性载体，吸附力弱，操作条件温和，不需要有机溶

剂，对高分子物质有很好的分离效果。常用的凝胶有SephadexG系列。凝胶层

析可用于脱盐、分离提纯、测定高分子物质的分子量、高分子溶液的浓缩等。在

峰谱图中，出峰顺序是：大分子先流出层析柱，小分子后出。

凝胶过滤层析纯化的分离原理

特点：层析所用的凝胶属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条件比较

温和，可在相当广的温度范围下进行，不需要有机溶剂，并且对分离成分理化性

质的保持有独到之处。对于高分子物质有很好的分离效果。

4、疏水相互作用层析

依据生物分子间疏水性差别实现分离的一种层析方式。高离子强度下，增进

蛋白质中的疏水性氨基酸与层析介质间的疏水性相互作用，削弱其静电作用力。

洗脱时，降低流动相离子强度，削弱蛋白质分子与层析介质间的疏水作用，实现

目的蛋白的纯化和收集。

疏水相互作用层析纯化的分离原理

特点：疏水作用层析也属于吸附性分离方式，对具有疏水特性的目的蛋白具

有高选择性和浓缩等特点。疏水相互作用层析可以用于捕获、中度纯化或精细纯

化阶段。由于样品应该在高些的盐浓度下来促进疏水相互作用，疏水相互作用层

析很好的适用于在硫酸铵沉淀样品沉淀后的捕获步骤或在离子交换层析后直接

进行中度纯化步骤。

5、反相层析技术

用反相层析分离生物分子依赖于洗脱液中样品分子和介质可逆的疏水相互

作用。起始条件主要是水相的，有利于高度有序的水结构围绕着样品分子。通常

的，一小部分有机修饰剂，通常是3%-5%的乙腈