细胞的原代与传代培养.ppt

第21页,共27页，星期六，2024年，5月VSMCs传代培养第1天和第3天（×100）第22页,共27页，星期六，2024年，5月（二）悬液细胞的传代培养（1）取生长良好的细胞，在超净工作台用无菌吸管把培养瓶中的细胞吹打均匀。（2）转移到无菌的离心管中，盖紧胶盖，平衡后离心（1000r/min）5min。（3）在超净工作台中吸去上清液，加入适量新培养液，用吸管吹打细胞，制成悬液。（4）以1：2或1：3进行分装，并在培养瓶上做好标记，注明代号、日期，轻轻摇匀，37℃CO2培养箱培养。（5）观察：细胞培养24h后，即可进行观察。第23页,共27页，星期六，2024年，5月传代细胞培养结果一般情况，传代后的细胞在2小时左右就能附着在培养瓶壁上，2～4天就可在瓶内形成单层，需要再次进行传代第24页,共27页，星期六，2024年，5月三、人体活检(或手术)材料(1)在准备以临床材料为实验材料时,要预先与临床外科医生和护士商量,并做好一切必要的准备工作。争取拿到新鲜、无菌、少坏死的标本。(2)与临床联系好手术时间后，立即做好如下准备工作：准备好1-2个贮有培养液和抗生素的标本收集瓶，将盖盖紧，保持无菌，瓶外贴上标签，写上工作人员名字、地点和电话号码；将收集瓶送往医院，并与医生和护士讲清截取手术标本的部位及注意事项。第25页,共27页，星期六，2024年，5月(3)标本放入收集瓶后，送出手术间，立即送往组织培养实验室。工作人员最好是等在手术间外。但有时手术时间难以掌握。则请护士将收集材料的瓶子盖好后，放入4℃冰箱，尽快打电话通知工作人员。(4)取临床标本时，虽然尽可能做到无菌操作，但仍有污染可能性的存在。可选用抗生素类控制污染。如手术标本比较大（约200mg以上），可将其浸于70%酒精中约30-60秒，这样会减少表面污染而不损坏内部组织的结构和存活。不要用纱布包裹标本，纱布纤维易粘附在组织上。第26页,共27页，星期六，2024年，5月感谢大家观看第27页,共27页，星期六，2024年，5月关于细胞的原代与传代培养一、原代培养概念：取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长的细胞在传代之前称为原代培养。第2页,共27页，星期六，2024年，5月原代培养技术的重要意义:原代培养的最大优点是细胞刚刚离体，生物性状尚未发生很大变化，具有二倍体的遗传性，而且大多数细胞表现出原来组织的特性。利用原代培养做各种实验，如药物测试、细胞分化及病毒学方面的试验效果很好。原代培养也是建立各种细胞系（株）必须经过的阶段。第3页,共27页，星期六，2024年，5月原代培养消化法：这种培养过程主要是采用无菌操作的方法，把组织（或器官）从动物体内取出，经酶消化处理，使分散成单个细胞，然后在人工条件下培养，使其不断地生长和繁殖。消化法贴块法冷消化温消化一次性消化分次消化第4页,共27页，星期六，2024年，5月贴块法消化法原代培养方法分类第5页,共27页，星期六，2024年，5月93分次消化消化法的分类第6页,共27页，星期六，2024年，5月解离释放细胞的方法最常用的是机械解离细胞法、酶学解离细胞法以及螯合剂解离细胞法。用酶学解离细胞法解离细胞是体外培养动物细胞时分散组织的基本方法，最常用的消化酶是胰蛋白酶和胶原酶两种。第7页,共27页，星期六，2024年，5月动物细胞原代培养流程的示意图第8页,共27页，星期六，2024年，5月器材和液体的准备细胞培养用的玻璃器材培养瓶、吸管等在清洗干净以后，装在铝盒和铁筒中，干热或湿热灭菌后备用手术器材、瓶塞等15磅，121℃，20分钟蒸气灭菌DMEM培养液、消化液、PBS液等用滤器过滤后备用???第9页,共27页，星期六，2024年，5月

方法与步骤（举例:心肌细胞消化培养法）（1）动物处死：将出生2～3d乳鼠，用拉颈椎方法处死。腹部向上钉在蜡盘中，用碘酒和酒精棉球擦拭腹部消毒。（2）剪取心脏：在无菌条件下将心脏（心尖）取出，置于无菌培养皿中，用Hanks液洗涤1-2次去除血污；放入另一培养皿中，纵向剪开心脏，仔细去除心腔内血污后剪成1mm3大小的组织块，再并用Hanks液洗涤2～3次，直到液体澄清。第10页,共27页，星期六，2024年，5月（3）消化及分散组织块：将上述清洗过的组织放入无菌三角烧瓶内，加入5～6倍量的0.1％胰蛋白酶液（pH7.4