乳鼠肾细胞的原代培养.pptVIP

原代培养细胞体外生存过程原代培养期传代期衰退期细胞分离技术离心分离法机械分离法化学分散法细胞表面抗原（电泳、流式细胞仪）等培养细胞的纯化自然纯化人工纯化酶消化法反复贴壁法机械刮除法克隆法培养基限定法流式细胞仪细胞冻存与复苏基本原则:慢冻快融冻存冻存保护剂:甘油、二甲基亚砜（DMSO）复苏37℃水浴中，30秒-1分钟，充分摇动使其急速融化。活性检测染色排除法MTT比色法乳鼠肾细胞的原代培养实验器材与试剂器材超净工作台、倒置显微镜、二氧化碳培养箱、水浴锅、高压灭菌锅、离心机、滤器酒精灯、酒精棉、镊子、器械缸、废液缸、记号笔,蜡盘、大头针、眼科剪、眼科镊,移液器架、移液器、吸头,试剂瓶、试剂瓶架,平皿、细胞培养瓶、离心管等试剂PBS溶液0.25%胰蛋白酶—0.02%EDTA溶液DMEM培养基（含10%FBS及双抗）实验方法与步骤（一）将乳鼠（3天左右）断头放血致死。进入无菌间,用70%乙醇消毒乳鼠体表,将其固定在蜡盘上。在超净台内,将其背部皮肤剪出一个“工”字型开口,然后将皮肤拉开,固定在蜡盘上,使其腰背部肌肉暴露出来。实验方法与步骤（二）用70%乙醇消毒背部肌肉,在脊柱两侧各剪一切口,取出肾脏,置于盛有PBS溶液的平皿中,除去肾膜与脂肪。纵向将肾脏剪开,除去肾盂。将肾脏剪成数块,用PBS溶液再洗涤一次。吸去PBS溶液,将肾脏剪碎（小而均匀）。加入0.5mL胰酶—EDTA溶液,于37℃消化15～20分钟,直至组织块变白、呈疏松状（镜检可见分散的细胞）加入0.5mL含血清DMEM培养基终止消化,反复“吹打”分散细胞去除大块组织后,1000rpm离心10min；弃上清加入PBS溶液重复洗涤、离心一次加入1mL含血清DMEM细胞培养液重悬细胞；取少量细胞悬液（20uL）,以PBS溶液稀释后进行计数将细胞悬液按比例稀释后,分装至10mL培养瓶中（每瓶1.5mL,每瓶80～100万细胞）,37℃、5%CO2培养1～2日后,观察细胞生长状况,并更换部分或全部培养液细胞生长成单层后,即可进行传代消化法消化结果将组织小块（约1mm3）均匀摆放在培养瓶壁上,平均间隔0.5cm翻转培养瓶,加入1mL含血清DMEM细胞培养液瓶口部稍向上倾斜,置于二氧化碳培养箱中（37℃、5%CO2）2hr后,将培养瓶轻轻翻转,继续培养72hr后可以观察到生长晕,继续培养3～5日,更换部分或全部培养液待生长晕相连后,去掉组织块,继续培养3～4日,即可进行传代培养组织块法