IF（免疫荧光）实验宝典白皮书.pptx

制备细胞或组织

•组织

•铺板条件

•优化细胞密度和改善细胞健康状态

固定—稳定和保存样本

•固定剂的选择

•固定孵育时间通透化处理

•去污剂或醇类的选择

•对于石蜡包埋的组织：脱蜡/复水和抗原修复步骤

免疫荧光实验获得成功的9大步骤

数据收集和成像

如需实验对照方面的更多数据，请访问

/ifvalidation

设计实验

•实验对照

•选择抗体和荧光基团：直接与间接检测法

•多重分析

封闭

•封闭剂的选择免疫染色

•一抗稀释

•清洗和二抗孵育

●

3 4

5

6

●

复染（可选）

封固样本

经严格验证的抗体至关重要

一抗是IF实验的关键成分，其性能可直接影响到数据质量。能用于免疫印迹法(WB)检测特异性条带的抗体无法充分保证适于IF实验（见下图）。这是因为WB分析将蛋白置于容易导致还原/变性的恶劣条件中，使蛋白结构发生变化。经验证可用于WB的抗体所识别的表位，在IF中，因为蛋白维持其天然状态，则可能会被隐藏和/或被掩盖。

验证特异性以避免误导性IF结果

α-Synuclein蛋白在脑组织高度表达，其功能异常是导致神经退行性疾病（比如帕金森病）的重要原因。在健康组织中，α-Synuclein一般位于突触前末梢，与突触囊泡相关联。CST科学家按照制造商建议的稀释浓度，对α-Synuclein(D37A6)XP®RabbitmAb#4179和另一家公司的α-Synuclein抗体进行了平行对比。两种抗体在WB中检测结果均符合预期。在IF中，观察到#4179在中脑区的染色斑点与α-Synuclein在突触前区的位置分布相一致；而另一家公司的抗体点状分布较不明显，甚至显示错误染色在细胞核或神经元胞体（箭头所示）中。这项实验显示针对相关应用进行验证至关重要。(A)

(A)某抗体在WB分析中显示清晰条带并不能充分保证其在IF分析中也具备相应良好表现和可靠性。使用α-Synuclein(D37A6)XP®RabbitmAb#4179或另一家公司的α-Synuclein抗体，对小鼠和大鼠的脑提取物进行WB

分析（左图）。使用#4179（上排）或另一家公司的抗体（下排），对[小鼠]中脑下部和海马体切片进行共聚焦IF分析（右图）。白色箭头表示另一家公司的抗体错误地将

α-Synuclein标记在神经元胞体/细胞核。

1212

1：小鼠脑

2：大鼠脑

中脑下部海马体

另一家公司#4179

140

100

80

60

50

40

30

20

10

另一家公司的抗体

CST#4179

设计实验

实验对照

采取适当的对照十分重要，这有助于确定样本间差异是实验唯一变量，以及试剂（含抗体）的表现符合预期。此类对照包括进行药物学处理、添加胞外配体来调控信号转导通路或比较具有不同基因表达（knockout、siRNA等）的细胞。通常变量和对照是平行的，这样固定和后续步骤可以同时进行。采用哪种对照取决于实验类型。下文提供了几个示例，是我们的科学家在IF-IC中评估抗体性能时所采用的对照方式。其中一些可供您在确认所研究细胞类型的特异性时加以借鉴。

敲除细胞系以验证靶标特异性

如果您正在研究的靶标有多种异构体，那么使用敲除细胞系作为对照可能很有用。比如，糖原合成酶激酶(GSK-3)有两种基因编码，分别为GSK-3α和GSK-3β,它们在不同丝氨酸残基位点被调控。在进行IF实验的时候，您可能想知道所用抗体是能识别其中一种异构体，还是能识别两种异构体，还是都不能。可以使用已知对目标靶标的表达呈阳性或阴性的细胞来确认实验结果。在右图IF中，使用野生型（GSK-3β阳性）、GSK-3α敲除（GSK-3β阳性）和GSK-3β敲除（GSK-3β阴性）小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)显示GSK-3β(D5C5Z)XP®RabbitmAb#12456特异性地识别出了正确的异构体。(B)

通过调节靶标磷酸化状态来确认磷酸化特异性

对翻译后修饰(PTM)（包括磷酸化、乙酰化、泛素化、剪切等）有特异性的抗体可以揭示靶蛋白的生物学功能等重要信息。有些情况下，PTM的变化可能会与蛋白表达和/或定位的变化相吻合。因此，可以使用酶类或化学激活剂和/或