生物：3.1《酶的制备及活力测定》课件(中图版选修1).ppt

3.1酶的制备及活力测定实验目的和要求1.掌握盐析法制备活性蛋白质的原理及方法。2.掌握过氧化物酶的活力测定方法。辣根过氧化物酶的制备及活力测定过氧化物酶催化以下反应2H2O2→O2+2H2O这一类酶以铁卟啉为辅基，所以属血红素蛋白质类(hemeproteins)。过氧化物酶在生物界分布极广，在细胞代谢的氧化还原过程中起重要的作用。辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase，简称HRP，EC.)是植物中研究得最深入的一种过氧化物酶，早在20世纪30年代就有人着手从辣根中分离此酶，以后又制备出结晶。本实验是以辣根为原料，经过水的抽提，硫酸铵和丙酮分级分离，再经锌离子纯化，透析除盐，冰冻干燥，便可得到高纯度的辣根过氧化物酶。辣根过氧化物酶是一种含亚铁血红素的蛋白质,Mr在40000左右，等电点7.2。溶于水，溶解度为5%(W/V)，溶液呈棕红色，透明。HRP可溶于0.58饱和度以下的硫酸铵溶液，而0.62饱和度以上则不溶。该酶最适pH7.0(对愈创木酚为氢给体而言)。在室温下，HRP几周内稳定，加热到63℃，在15min内稳定。氧化还原电势很低，pH6.08时，E0=-0.2070V，pH为7.71时，E′0=-0.2787V。1.RZ值：提纯工作的后几步，以及纯酶溶液可用RZ值表明酶的纯度。RZ=A403nm/A275nm，403nm处的吸收代表血红素辅基的吸收，275nm的吸收是蛋白质的吸收，结晶的HRP的RZ值为3.04。测定时的酶浓度为1mg蛋白/mL。2.愈创木酚法：测k4。以愈创木酚(邻甲氧基酚，guaiacol)为氢给体，其反应产物四邻甲氧基连酚.有色产物四邻甲氧基连酚生成的速度(dx/dt)与底物过氧化氢及氢给体愈创木酚的浓度有关。本实验是采用测定k4的方法来判断酶的纯度。一、HRP的制备1.水提取：称取5kg用水冲刷干净的鲜辣根(辣根皮中亦含有丰富的HRP)，用菜刀切成小碎块，在绞肉机中绞碎1～2次。碎渣浆用1倍体积的水低温下搅拌提取过夜(亦可采用高速抽提法)。次日用甩干机(或离心机)甩干，收集滤液，碎渣再用1/4倍体积水浸泡提取1次，合并2次滤液，测得总体积。2.硫酸铵分级分离：在不断搅拌下，每1000mL滤液中慢慢加入226g硫酸铵粉末(相当于0.40饱和度，0℃)，大约在1～2h内加完，置冷室中放置过夜。次日将上清液小心地用虹吸管移出，下面混浊液以3000r/min离心15min，弃沉淀，合并上清液。再按每1000mL上清液加258g硫酸铵粉末(0.8饱和度)随加随搅拌，当硫酸铵全部溶解后，置冷室过夜。次日，虹吸出上清液，沉淀部分在冰冻离心机中以13000r/min离心20min，弃去上清液，收集沉淀。将沉淀悬浮于100～150mL蒸馏水中(加水量要使沉淀全部溶解为止)，分装于透析袋内，放在流动自来水中进行透析1～2天，直到硫酸铵透析完毕为止(可用5%乙酸钡溶液或奈氏试剂进行检查)。然后改换成用蒸馏水透析，中间更换2～3次，用0.1mol/L硝酸银溶液检查透析外液无氯离子为止。将透析液合并，在冰冻离心机中以4000r/min离心15min，弃去沉淀，量上清液的体积。3.丙酮分级分离：将上清液倒入烧杯并置冰盐浴中，在不断搅拌下，用细滴管沿杯壁加入1倍体积预冷至－15℃的丙酮，放置片刻，在冰冻离心机中以4000r/min离心15min，弃去沉淀。上清液再加入0.8体积(按原上清液体积)－15℃丙酮，(操作同上)，静置后，在冰冻离心机中离心收集沉淀。将沉淀溶于少量蒸馏水中，透析除丙酮。可得RZ值近于1的酶溶液。4.精制：将上步酶液适当稀释，滴加1mol/L硫酸锌溶液，使酶液中锌离子浓度为10-3mol/L，5000r/min离心10min，得上清液。再将沉淀用少量蒸馏水洗涤，离心，洗液与清液合并，分装于透析袋内，用水透析除盐，用微孔滤膜过滤，进行真空冰冻干燥(约得20mg)，产品呈米黄色纤维状松软物，HRP产品的RZ值可达3.0左右，置真空干燥器中低温保存。二、HRP的活力测定1.活力测定：测定k4值的方法操作如下：取2个比色池(带盖，光程1cm)，按表加入反应物。对照样品反应物磷酸盐缓冲液2.91mL2.90mL愈创木酚溶液0.05mL0.05mL酶液0.0mL0.01mL酶液：将1mg蛋白/mL的酶液用磷酸盐缓冲液稀释10倍后使用。加好反应物，摇匀，在470nm读出A470nm值，为t=0时的读数。立即加0.01mL40mmol/L过