细胞融合的方法过程和影响因素.ppt

基于HAT培养基的筛选系统H（Hypoxanthine次黄嘌呤）应急途径中所提供之外源核苷酸前体A（Aminopterin，氨基喋呤）阻断核苷酸的从头合成T（Thymidine，胸腺嘧啶）应急途径中所提供之外源核苷酸前体HGPRT酶缺陷型细胞株（长期培养系）不能在HAT培养液中生长正常细胞体外生存能力有限，最终也将死亡融合细胞最后，只有融合细胞在HAT培养液中存活第31页,共46页，星期六，2024年，5月第三节融合细胞克隆化利用单个细胞培养技术选育出遗传稳定的分泌特异抗体的细胞系。在培养过程中，一般要加能释放某些生长因子促进杂交瘤生长的饲养细胞，如小鼠的腹腔巨噬细胞、脾细胞或胸腺细胞等。方法有有限稀释法、软琼脂培养法、显微操作法、应用荧光激活分选仪等。第32页,共46页，星期六，2024年，5月通过适当的稀释达到分离单个细胞进行培养的目的1）取出阳性孔内的细胞进行计数2）用培液将其稀释到例如每毫升内10个细胞。3）如果在96孔板内每孔加0.1ml，每孔内将为一个细胞4）加入一定数量的饲养细胞，经过8~12天后，可观察到有集落生长的孔。5）根据检测的阳性结果再次进行克隆化。有限稀释法第33页,共46页，星期六，2024年，5月在加入饲养细胞的无菌平皿内铺上一层0.5％的琼脂，待凝固后再铺上一层混有杂交瘤细胞的0.25％的软琼脂。待细胞长成集落后，用毛细管吸出移种于含饲养细胞的96孔板内。软琼脂培养法第34页,共46页，星期六，2024年，5月第四节杂种细胞在细胞生物学研究中的应用1）基因定位不同种属的细胞融合时，常会出现一个亲本细胞的染色体被优先排除，而另一个亲本的染色体被选择性留下，即染色体分离的现象。由此，可根据表型和与表型特征相对应的基因在特定染色体上。例如：HGPRT－人细胞与TK－的小鼠细胞融合后，可用HAT培养基分离得到一种仅含一条人E组染色体的杂种细胞，具有TK活性，由此得到人的TK基因是在E组染色体上的。第35页,共46页，星期六，2024年，5月2）体细胞杂种的致瘤性分析通过正常二倍体细胞和致瘤性或病毒转化细胞的融合来进行致瘤性的遗传分析。3）遗传缺陷的基因互补基于杂种细胞的基因互补作用，可分为基因间和基因内的互补作用，即杂种细胞可以具有两种亲本在遗传上缺陷的基因表型。通过这种基因互补，可以用正常基因来治疗由于基因突变或基因缺失的疾病。第36页,共46页，星期六，2024年，5月4）分化功能表达调控的研究通过细胞融合可将不同分化状态或组织类型的细胞构建成为能够存活的种内或种间杂种，同时对杂种细胞内的基因组和胞质观察和分析，了解如何通过相互作用而最终导致原先表达的分化性状熄灭或保留。第37页,共46页，星期六，2024年，5月第38页,共46页，星期六，2024年，5月第39页,共46页，星期六，2024年，5月第40页,共46页，星期六，2024年，5月第41页,共46页，星期六，2024年，5月第42页,共46页，星期六，2024年，5月第43页,共46页，星期六，2024年，5月第44页,共46页，星期六，2024年，5月思考题1什么是细胞融合？有怎样的意义？2细胞融合的主要方法有哪些？各有什么特点？3HAT的选择原理是什麽？第45页,共46页，星期六，2024年，5月感谢大家观看第46页,共46页，星期六，2024年，5月**20世纪80年代兴起，以电降解及双向电泳的联合作用为基础，在高频交流电脉冲的诱导下，两个细胞膜表面的电荷和电位发生改变，导致该区域膜结构紊乱，出现许多微膜孔，相邻两个细胞紧密排列的微孔会有物质交流，形成膜桥和质桥，近而产生融合。当外加电场被撤除后，孔道由细胞自行修复，细胞膜通透性和功能恢复正常。**20世纪80年代兴起，以电降解及双向电泳的联合作用为基础，在高频交流电脉冲的诱导下，两个细胞膜表面的电荷和电位发生改变，导致该区域膜结构紊乱，出现许多微膜孔，相邻两个细胞紧密排列的微孔会有物质交流，形成膜桥和质桥，近而产生融合。当外加电场被撤除后，孔道由细胞自行修复，细胞膜通透性和功能恢复正常。**融合的基本过程：A、细胞膜的接触：当细胞置于电导率很低的溶液中时，电场通电后，电流即通过细胞，在电场作用下极化而产生偶极子，从而使细胞紧密接触排列成串；B、膜的击穿：细胞成串排列后，立即给予高频直流脉冲就可以使细胞膜击穿，从而导致两个紧密接触的细胞融合在一起。C、关于融合参数：电融合中的主要参数包括交流电压、交变电场的振幅频率、交变电场的处理时间；直流高频电压、脉冲宽度、脉冲次数等。**融合细