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实验七

蛋白质免疫印迹实验

〔WesternBlotting〕

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一实验原理

nWesternBlotting是用来检测蛋白质的一种技术。

n首先将含有待测蛋白的蛋白质混合物进行凝胶电泳别离，

然后将已经别离的蛋白质通过电泳技术从凝胶转移到固

体支持物上，这一固体支持物目前常为硝酸纤维素薄膜。

随后以待测蛋白质上抗原决定簇特异性的抗体〔称为第

一抗体〕为探针，与固体支持物上的蛋白质进行免疫反

响，最后用偶联有辣根过氧化物酶或碱性磷酸酯酶的抗

第一抗体的抗体〔第二抗体〕与第一抗体进行免疫反响，

只有与第一抗体特异性结合的待测蛋白才能与第二抗体

发生免疫反响。在有辣根过氧化物酶的底物用显色剂存

在时就会出现颜色反响，结合有第一抗体、第二抗体的

待测蛋白，通过颜色反响即能显现出来。

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一实验原理

n电泳将蛋白质从凝胶转移到固体支持物

上是通过电转移仪器完成的。它是将固

体支持物面对阳极、凝胶面对阴极，二

者结合在一起，然后将外面二侧用

Whatman3MM滤纸结合，形成“三明治

〞结构，放入电转移仪器上，参加电

缓冲液，通上电源后，蛋白质即可从凝

胶上转移到固体支持物上。

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一实验原理

其定量关系符合以下公式：

nVe=Vo+KV1

nVe：某一溶质的洗脱体积

nVo：层析柱的外水体积

nVi：层析柱的内水体积

nK：某一溶质的分配系数

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二试剂和器材

1．试剂

电转移缓冲液pH8.3

39mM甘氨酸

4.8mMTris碱

0.037%SDS

20%甲醇

混合2.9克甘氨酸，5.8克Tris,0.37克SDS,加200m甲醇，

定容到1000ml.

封闭缓冲液：5%〔W/V〕脱脂奶粉溶于PBS中

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二试剂和器材

1．试剂

PBS:NaCl8g,KCl0.2g,Na2HPO41.44g,KH2PO40.24g

加双蒸水800ml,用HC调pH到pH7.4,再加水到1000ml,

分装后，15磅20分钟灭菌。

4-氯萘酚显色液：用30mg4-氯萘酚〔简称4-CN〕溶于

1m无水乙醇中制成母液。将50μ14-CN对母液和

5μ130%的H2O2参加到5ml0.05M/LTris-Cl(pH7.6)中。

氨基黑染色液：0.1%氨基黑10-B、45%甲醇、10%冰乙

酸

氨基黑脱色液：90%甲醇、2%冰乙酸、8%水

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二试剂和器材

2．器材

n电转移仪器

n恒温摇床

n硝酸纤维素薄膜

nWhatman3MM滤纸

n电泳仪裁纸刀

nφ25cm培养皿玻璃棒

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三操作步骤

n1蛋白质电转移

n戴上手套，取下SDS凝胶，小心剥离凝胶。裁剪与凝胶同样大的

硝酸纤维素薄膜和六层Whatman3MM滤纸，在硝酸纤维素薄膜左下角