细胞周期的调控与检测.ppt

1:222-231MutationofG1/Sregulatorsinhumancancer第32页,共45页，星期六，2024年，5月八、常用的细胞周期检测方法流式细胞术PI(碘化丙锭),可以与细胞内DNA和RNA结合,采用RNA抑制剂将RNA消化后,通过流式细胞术检测到的与DNA结合的PI的荧光强度直接反映了细胞内DNA含量的多少。由于细胞周期各时相的DNA含量不同,因此,通过流式细胞术PI染色法对细胞内DNA含量进行检测时,可以将细胞周期各时相区分为G1/G0期,S期和G2/M期,并可通过特殊软件计算各时相的百分率:G1/G0期具有二倍体细胞的DNA含量(2N),G2/M期具有四倍体细胞的DNA含量(4N),S期的DNA含量介于二倍体和四倍体之间。值得注意的是,PI不能通过细胞膜完整的细胞(如活细胞和早期凋亡细胞),在标本制备时,必须先用乙醇或其他破膜剂增强细胞膜的通透性,才能使PI进入细胞内与细胞内的核酸结合。乙醇通常为终浓度为70%的冷乙醇。第33页,共45页，星期六，2024年，5月将肿瘤细胞以1×106接种于60mm培养板，80％汇合后传代。24－72小时后用胰酶消化收集细胞，PBS洗两遍，弃上清，加入70％预冷乙醇中，吹打均匀，4℃固定12小时以上。PBS洗涤去乙醇，1000rpm,5min，洗两遍。0.5mlPBS重悬细胞，加入PI和RNaseA至终浓度50μg/ml，37℃温浴30min。用流式细胞仪测定周期。

PI：碘化丙啶，以PBS配成1mg/ml，4℃保存。

RNaseA：10mg/mlD、方法：第34页,共45页，星期六，2024年，5月G2MG0G1s02004006008001000G0G1sG2MDNAAnalysisDNAcontentCount2N4NNormalCellCyclePurdueUniversityCytometryLaboratories第35页,共45页，星期六，2024年，5月G1SphaseG2MG1121DNAcontentTheCellCycleDNAcontentbyflowcytometryDeconvolutionintocellcyclephasesG0/1G2/MSEvents第36页,共45页，星期六，2024年，5月MeasurementofsubG0/1apoptoticparticlesDNAcontentEventsEventsG0/1G2/MSApoptosis第37页,共45页，星期六，2024年，5月4hr,control28hr,irradiatedG1:94.1%S:1.5%G2/M:4.4%G1:94.1%S:1.1%G2/M:4.8%G1:60.6%S:34.9%G2/M:4.5%G1:96.6%S:1.6%G2/M:1.8%10%1%90%4%28hr,control28hr,aphidicolin第38页,共45页，星期六，2024年，5月Ohr6hr12hr18hr24hr93.5%86.5%58.5%21.0%2%Inductionofp21resultsinparallellossofNPATfoci,down-regulationofhistonegeneexpressionandinhibitionofSphaseentry(1)2hr4hr6hr8hr10hr12hr14hr24hr0hrG1:47.2%S:34.2%G2/M:18.7%G1:46.3%S:34.9%G2/M:18.8%G1:51.9%S:29.8%G2/M:18.4%G1:56.1%S:23.9%G2/M:20.1%G1:57.8%S:17.8%G2/M:24.5%G1:58.5%S:12.5%G2/M:29.0%G1:60.2%S:6.8%G2/M:33.0%G1:60.0%S:3.9%G2/M:36.1%G1:62.1%S:2.4%G2/M:35.5%B.A.第39页,共45页，星期六，2024年，5月2、BrdU掺入法(Sphase)A、原理：