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微生物的分离纯化

任务描述

某食品企业用于发酵的菌种混入杂菌，需进行分离纯化，得到纯培养物，请根据企业要求利用学院微生物实验室的条件完成任务。

任务要求

完成本学习任务后，你应该能：

1、说出微生物纯培养的概念，并理解其含义；2、能说出微生物分离和纯化的基本原理；

3、能说出分离纯化的主要方法技术；

4、能对微生物进行分离纯化，具备良好的无菌观念；5、具备一定服务意识、具有接受和执行上级主管布置

工作任务的积极态度。

任务准备——知识准备

为了完成任务，获取所需的相关知识，需完成的思考题：

1、什么叫做无菌技术？

2、什么叫做纯培养？

3、分离和纯化的目的及基本原理是什么？

4、什么是稀释倒平板法？

5、什么是涂布平板法？

6、什么是平板划线分离法？需注意哪些方面？

微生物的分离、纯化技术相关知识

微生物的分离、纯化技术

在自然界中，不同种类的微生物绝大多数都是混杂生活在一起的，为了生产和科学研究的需要，须从混杂的微生物中分离得到某一种微生物，

这种获得纯培养物的方法称为微生物的分离与纯

化。

(-)平板划线分离法

??

??

第一区划线I灭菌接种环第二区划线（一）平板划线分离法--注意事项

第一区划线

I

灭菌接种环

第二区划线

划线时接种环与平皿约成

划线时接种环与平皿约成30-40

度角,轻轻接触,以腕力在琼脂表

面轻快滑动,不能划破琼脂。划线要密而不重复，充分利用平板的表面，划线应占满平皿。每次划完后应灭菌。

灭菌接种环

第三区划线

I

灭菌接种环

（一）平板划线分离法--种类

分区交叉划线法连续划线法

适用于含菌量较少的标本适用于含菌量较多的标本

适用于含菌量较少的标本

平板划线方式：

划线的形式有多种，可将一个平板分成四

个不同面积的小区进行划线,第一区(A区)面积最

小，作为待分离菌的菌源区，第二和第三区(B、C区)是逐级稀释的过渡区，第四区(D区)，则是关键区，使该区出现大量的单菌落以供挑选纯种用。为了得到较多的典型单菌落,平板上四区

面积的分配应是DCBA。

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划线操作：

(1)挑取他含菌样品:选用平整、圆滑的接种环，按无菌操作法挑取少

量菌种。

(2)划A区:将平板倒置于煤气(酒精)灯旁,左手拿出皿底并尽量使平板垂

直于桌面，有培养基一面向着煤气灯(这时皿盖朝上，仍留在煤气灯

旁)，右手拿接种环先在A区划3-4条连续的平行线(线条多少应依挑菌量的多少面定)。划完A区后应立即烧掉环上的残菌，以免因菌过多而影响后面各区的分离效果。在烧接种环时，左手持皿底并将其覆盖在皿

盖上方(不要放入皿盖内)，以防止杂菌的污染。

(3)划其他区:将烧去残菌后的接种环在平板培养基边缘冷却一下，并使B区转到上方，接种环通过A区(菌源区)将菌带到B区，随即划数条致密的平行线。再从B区作C区的划线。最后经C区作D区的划线，D区的线条应与A区平行，但划D区时切勿重新接触A、B区，以免极该两区中

浓密的菌液带到D区，影响单菌落的形成。随即将皿底放入皿盖中。

烧去接种环上的残菌。

5.恒温培养:将划线平板倒置，于37℃(或28℃)培养，24hr后观察。

挑单菌落挑取单个菌落，转移至液体培养基中增菌，重（二）稀释倒平板法

挑单菌落

挑取单个菌落，转移至

液体培养基中增菌，重

样品材料稀释，倾入平板，

在浓度比较低的平板上可得到单菌落。

梯度稀释

吸取稀释液1ml，放入培养皿中，然后倒入15-20ml已融化并且冷却至50℃左右的培养基，

倒混菌平板加盖后轻轻摇动培养皿，使均匀分布，待凝固后即成平板。

倒混菌平板

将平板倒置恒温箱中培养

保温培养24～48小时，检查分离结果。

保温培养

复以上操作数次，便可

复以上操作数次，便可得到纯培养。

倒平板技术

倒平板技术

（二）稀释倒平板法

1ml1ml1ml1ml

1ml

1ml

1ml

1ml

1ml

l

9ml

生理

盐

水

各

1ml

各

1ml

各

1ml

1ml1ml1ml1ml1ml释样品材料系列稀1ml9ml生理盐水将一定量（0.1或0.2mL）的某

1ml

1ml1ml1ml1ml

释

样品材料系列稀

1ml

9ml

生理盐水

将一定量（0.1或0.2mL）的某一稀释度的样品悬液滴加在平板表面，再用无菌玻璃涂棒将菌液均匀分散至整个平板表面

将平板倒置恒温箱中培养

24～4