医学教程 4非肠道原核细菌基因工程(正).ppt

E芽孢杆菌的分泌表达系统可诱导型操作子：A.大肠杆菌的lac系统，包括lacI阻遏蛋白编码基因B.λ或φ105噬菌体的操作子区及温度敏感型阻遏蛋白基因C.枯草芽孢杆菌蔗糖可诱导基因sacB的调控序列链霉菌的基因工程A链霉菌的生物学特征B链霉菌的载体克隆系统C链霉菌的宿主转化系统D链霉菌的基因表达调控系统E链霉菌的蛋白分泌系统F利用DNA重组技术改良抗生素生产菌革兰阳性、好氧、丝状、原核细菌生长周期：孢子发芽、营养菌丝和气生菌丝形成、孢子生成具有完善的代谢和分泌系统，能够分解大多数稳定的生物多聚物以及一些人工合成的高分子化合物丰富的次级代谢途径以及初级代谢与次级代谢之间的严密调控体系60％以上抗生素由链霉菌合成B链霉菌的载体克隆系统链霉菌的野生型质粒：天蓝色链霉菌可转移性因子SCP2*(3lkb)：l-2个拷贝变铅青链霉菌非转移性质粒pIJ101(8.9kb)：40-300个拷贝两种质粒的复制子是相容性、不存在任何同源序列变铅青链霉菌66株+天蓝色链霉菌A3(2)株=接合后者染色体DNA的一段序列转入接合受体菌SLP1.2（4-5个拷贝）①pIJ702pIJ101衍生质粒、高拷贝复制,不易丢失、5.65kb、40-300拷贝非接合特性：鸟枪法克隆外源基因的载体，装载量10kb硫链丝菌素抗性筛选转化子+不产黑色素的白色克隆即为重组子(tsr+、mel-)②pIJ61pIJ61：质粒SLPl.2复制子、14.8kb、装载量比pIJ702大，拷贝数较少aph：氨基糖苷类抗生素(链霉素等)磷酸化失活具有典型的致死接合遗传标记---Ltz+；转化子--凹陷菌落--生长受到限制③pIJ922pIJ922：24kb、接合型质粒、SCP2*复制子、1-2拷贝标记：Ltz+、tsrEcoRⅤ克隆位点：凹陷菌落--转化子、硫链丝菌素敏感--重组子④pIJ699pIJ699：9.6kb、pIJl01复制子5.0kb+p15A大肠杆菌复制子4.6kb、穿梭载体质粒筛选标记：链霉菌硫链丝菌素抗性tsr、大肠杆菌紫霉素抗性基因vph和新霉素抗性基因neo空载的质粒，形成两个反向终止子结构，不能稳定复制，插入一段大于50bp的DNA片段可控制这种不稳定性⑤pIJ486／487pIJ486／487：启动子探针质粒、以pIJ702为基本框架、l00-200拷贝两者区别：新霉素抗性基因上游的多克隆位点MCS序列相反⑥pKC796pKC796：不含链霉菌复制子的整合型质粒、链霉菌温和型噬菌体+大肠杆菌质粒pKC787重组克隆转化大肠杆菌筛选重组子(Amr、lacZ’)转化链霉菌整合筛选attp：特异性整合位点KC噬菌体载体系列KC系列：用于链霉菌重组克隆系统的噬菌体载体组成：链霉菌?C31温和型噬菌体DNA、大肠杆菌质粒pBR322、链霉菌标记基因、attp特异性整合位点、噬菌体溶原维持的c基因温度敏感型的c突变基因(cts)---热诱导方法转入溶菌循环插入片段大小1.5-6.0kbC链霉菌的宿主转化系统1、原生质体转化法2、原生质体转染法3、完整菌丝体转化法变铅青链霉菌受体菌：变铅青链霉菌66株及其衍生物株---理想、应用广泛特点：不含内源型质粒、遗传背景清楚、易于质粒的转化操作、对外源DNA无明显的限制修饰作用能识别绝大多数链霉菌的启动子和终止子、能高效表达众多革兰氏阳性和阴性菌的基因拥有高效率的异源蛋白分泌系统1、原生质体转化法原生质体制备原生质体转化转化操作关键：加入DNA之前原生质体的洗涤、DNA与原生质体混合后，PEG缓冲液的迅速加入2、原生质体转染法噬菌体DNA以脂质体形式转染原生质体操作方法：缩醛磷脂酰胆碱+十八胺溶于氯仿旋转蒸抽去溶剂加入G缓冲液剧烈振荡室温下旋转蒸发数分钟加入KCl乙醇水溶液(乙醇：水＝1：10)室温下离心沉降悬浮液即为脂质体制备物原生质体离心去P缓冲液均匀悬浮加噬菌体DNA+脂质体悬浮液混合迅速加入PEGl000室温1min涂R2YE再生平板孢子覆盖30℃保温l8-24h噬菌斑计数和筛选转染率：线型DNA----5×107噬菌斑/ugDNA，连接液---降低1000倍3、完整菌丝体转化法TK23株受