醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质.pptVIP

*******醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质一、实验目的1.掌握电泳分离的蛋白质的基本原理2.熟悉醋酸纤维薄膜电泳技术二、实验原理（一）电泳:带电粒子在电场中向本身所带电荷相反的电极移动的现象。电泳技术:利用带电粒子在电场中移动速度不同而达到分离的技术。二、实验原理（二）蛋白质是两性电解质。血清中各主要蛋白质的等电点均低于pH7.0,在pH8.6的碱性缓冲液中,电离成负离子,在电场中向正极泳动。因血清中各种蛋白质的pI值不同,在同一pH缓冲液中带电荷量会有不同,此外,各蛋白质的分子大小和形状也不一致,所以在同一电场中,各蛋白质的电泳迁移率也不同。带电荷多、分子量小者,泳动较快,反之则慢。醋酸纤维薄膜电泳可将血清蛋白分成五条主要区带,从正极端起依次为清蛋白/白蛋白Alb,α1-球蛋白,α2-球蛋白,β-球蛋白,γ-球蛋白。这些蛋白经过染色处理,可展示出清晰的蛋白电泳图谱。如下图所示。二、实验原理（三）由于染色时,染料与蛋白质的结合与蛋白质的量成正比。因此可将实验图片扫描后,根据每个蛋白条带的光密度,采用软件计算每种蛋白质的相对含量。也可将各蛋白区带剪下,分别用一定量的NaOH稀溶液洗脱,进行比色,测出各蛋白质区带的相对含量。二、实验原理（四）蛋白定量:影响电泳的因素三、实验器材卧式电泳槽DYY-2型电泳仪醋酸纤维薄膜（CAM,2cm×8cm）:1片/人。染色缸1个，公用。漂洗缸3个，公用。点样器:公用。滤纸:公用。镊子:公用。脱色摇床扫描仪四、实验试剂巴比妥-巴比妥钠缓冲液（pH8.6，离子强度0.06）染色液（丽春红S染液）漂洗液:3%（V/V）冰醋酸迎着光辨别醋酸纤维薄膜（CAM）的光面和毛面。在毛面的一端1.5cm处,用直尺和铅笔轻划一横线,做点样标记,并用铅笔标号。将已经编号、标记的CAM膜以毛面朝下的方式浸入巴比妥缓冲液中,浸泡30min。五、实验操作实验准备:1）醋酸纤维薄膜的准备电泳装置由电泳槽和稳压电源两部分组成,两者之间有专门的连线连接。电泳槽的正负极各有一个装缓冲液的槽,红色为正极,黑色为负极。

电泳槽置于水平台,两侧注入等量的巴比妥缓冲液,使其在同一水平面。用双层纱布搭桥。2）电泳装置的准备1）用镊子取出浸透的薄膜,夹在两层粗滤纸内吸干多余的缓冲液,然后平铺在桌子上（毛面朝上）。2）在一次性手套上滴一滴血清（3-5μl）,用点样器在血清上蘸一下,再将点样器轻印在CAM膜的点样线上,待血清完全渗透到薄膜内后移开。2.点样1）将加样后的薄膜,毛面向下,垂直架于电泳槽的游杆两端,点样端置于负极,纱布将膜的两端与缓冲液连通2）将电泳槽的正极和负极分别与电泳仪的正极、负极连接,打开电源,低压,平衡5min。调节电压至90-150V(110V),稳压电泳45min。3）待电泳区带展开约25-35mm后,关闭电源。3.电泳电泳完毕后,取出薄膜,以毛面朝下的方式浸于丽春红S染色液中,染色5-10min。4.染色将染色过的薄膜依次放在漂洗缸1,2,3中漂洗,每次5min5.漂洗将漂洗好的CAM薄膜放置在滤纸上,吸干水分,放入扫描仪中进行扫描,并用软件分析各种蛋白质的相对含量。6.定量各组分蛋白%=AX/AT×100%AX:各组分蛋白光密度值AT:血清各组分蛋白光密度值之和7.计算*******