细胞生物学研究方法细胞生物学.ppt

************用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，次级电子的多少与电子束入射角有关，也就是说与样品的表面结构有关，次级电子由探测体收集，并在那里被闪烁器转变为光信号，再经光电倍增管和放大器转变为电信号来控制荧光屏上电子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图像。图像为立体形象，反映了标本的表面结构。为了使标本表面发射出次级电子，标本在固定、脱水后，要喷涂上一层重金属微粒，重金属在电子束的轰击下发出次级电子信号。****用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离。常用的介质为氯化铯，蔗糖和多聚蔗糖**组织化学或细胞化学染色（histochemicalorcytochemicalstaining）是利用染色剂可同细胞的某种成分发生反应而着色的原理，对某种成分进行定性或定位研究的技术。利用这种方法对细胞的各种成分几乎都能显示**********植物原生质体培养第63页,共94页，星期六，2024年，5月(三)非细胞体系在细胞生物学研究中的作用非细胞体系(cell-freesystem):来源于细胞，而不具有完整的细胞结构，但包含了进行正常生物学反应所需的物质（如供能系统和酶反应体系等）组成的体系即为非细胞体系。近年来，人们利用这一体系探讨了许多细胞生命活动中的重要问题，如DNA复制，RNA转录，蛋白质合成，膜泡运输，细胞周期调控、核膜及染色质的组装、核质运输机制等。第64页,共94页，星期六，2024年，5月二、细胞工程(cellengineering)(一)细胞融合（cellfusion）P44概念:细胞杂交（cellhybridization）同核体（homokaryon）异核体（heterokaryon）诱导细胞融合的方法:生物方法:化学方法:物理方法:第65页,共94页，星期六，2024年，5月细胞融合第66页,共94页，星期六，2024年，5月（二）、单克隆抗体技术克隆（clone）：对细胞来说，克隆是指由同一个祖先细胞通过有丝分裂产生的遗传性状一致的细胞群。1.血清抗体:抗原免疫系统（B淋巴细胞）抗体（混合物,抗血清)2.单克隆抗体:单个B淋巴细胞抗体（单一物质)专一性B淋巴细胞：体外培养肿瘤细胞：体外培养杂交瘤细胞单克隆抗体第67页,共94页，星期六，2024年，5月培养上清中X抗体的检测克隆化培养单克隆杂交瘤细胞培养上清中X抗体的检测杂交瘤细胞可持续分泌单克隆抗体规模化培养获得大量单克隆抗体动物免疫细胞融合混合细胞的HAT筛选)分泌X抗体B淋巴细胞骨髓瘤细胞X抗原B淋巴细胞瘤的突变株培养数天后细胞死亡无限生长细胞分泌X抗体只有杂交瘤细胞可长期存活下来BALB/c杂交瘤技术操作流程图解第68页,共94页，星期六，2024年，5月接受抗原刺激后，能分泌针对该抗原的特异性抗体，在体液免疫中具有重要功能。B淋巴细胞本身是一种终末分化细胞，通常不再进行细胞分裂，存活一段时间后便会死亡——短命细胞1.B淋巴细胞与骨髓瘤细胞的特性：B淋巴细胞(Blymphocytes)：杂交瘤技术与单克隆抗体第69页,共94页，星期六，2024年，5月骨髓瘤细胞(myelomacells):恶性增殖的转化细胞，只要营养条件适合可永远分裂和存活——长命细胞。经筛选与驯化，现已建立多种骨髓瘤细胞株——没有抗体分泌物。第70页,共94页，星期六，2024年，5月2.细胞融合技术：脾细胞(B淋巴细胞)骨髓瘤细胞杂交瘤细胞长命不分泌抗体分泌抗体短命分泌抗体长命K?hler和Milstein,19751984年Nobel医学奖第71页,共94页，星期六，2024年，5月3.杂交瘤细胞的筛选：脾细胞(B淋巴细胞)骨髓瘤细胞杂交瘤细胞脾细胞/?脾细胞骨髓瘤细胞/?骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞脾细胞筛选出不能长期存活不能长期存活第72页,共94页，星期六，2024年，5月H,次黄嘌呤;A,氨基喋呤;T,胸腺嘧啶DNA内源性途径(主要途径)谷氨酰胺or单磷酸尿苷酸二氢叶酸还原酶AHT外源性途径(旁路途径)