登革热实验室检测课件.pptVIP

登革热实验室检测云南省寄生虫病防治所2014年10月

概要检测目的检测对象检测内容实验室检测复核检测检测方法样本采集、保存和运输

检测目的及时发现、诊断病例。病毒分型和溯源。为登革热流行趋势的预测、预警和制定防治对策、措施提供科学依据。

检测内容实验室检测登革热疑似病例发生所在地医院和/或县（市）疾控机构采集病例血清，检测登革病毒抗原、核酸或抗体。

登革热疑似病例实验室检测流程

检测内容复核检测送州/市CDC或云南省寄生虫病防治所的临床标本，抽样30%进行复核检测，疫点首发病例需采用病原学和/或双份标本血清学方法复核检测，暴发疫情复核检测不少于5例，疫情少于5例者应全部检测，病毒核酸阳性标本应分型检测。疫点首发病例，重症病例、输入病例急性期标本应采用PCR方法进行分型检测，阳性者分离病毒，从临床标本或所分离病毒中扩增E蛋白编码基因，完成序列分析。实验室检测阴性临床病例以及重症病例，应对恢复期血清进行IgM、IgG抗体和/或中和抗体检测。

检测方法病原学检测主要适用于急性期血液标本。1、抗原检测：一般发病后5天内血液标本NS1抗原检出率高。标本中检出NS1抗原可以确诊病毒感染，适用于现场快速检测，可用于早期诊断2、核酸检测：一般发病后6天内血液标本病毒核酸检出率高。在病人血清中检出病毒核酸，可确诊而且能够分型，可用于早期诊断，但核酸检测容易因污染而产生假阳性，因此要求严格分区操作3、病毒分离：一般发病后5天内血液标本病毒分离率较高。将标本接种于蚊源细胞（C6/36）或哺乳动物细胞（BHK21、Vero）进行分离培养，出现病变以后，用检测抗原或核酸的方法鉴定病毒。分离到登革病毒可以确诊，但其耗时长，不适于快速诊断。

酶联免疫法检测登革病毒NS1抗原检测仪器设备和材料加样器、温箱、洗板机、含波长450nm的酶标仪、登革病毒抗原检测试剂盒（酶联免疫法）

酶联免疫法检测登革病毒NS1抗原结果判定1、临界值计算：临界值=0.10+阴性对照孔A值均值（阴性对照孔A值低于0.05者以0.05计算）。2、阴性对照的正常值范围：阴性对照孔A≤0.1（若1孔A大于0.1应舍弃，若两孔或两孔以上阴性对照大于0.1，应重复实验）。3、阳性对照正常值范围：A≥0.8.4、阳性判定：样品A值≥临界值者为登革病毒抗原阳性。5、阴性判定：样品A值＜临界值者为登革病毒抗原阴性。意义结合临床信息，阳性结果可以诊断为登革病毒感染，但阴性结果并不排除登革病毒感染的可能。

胶体金免疫层析法检测登革病毒NS1抗原结果判定1、阴性结果：仅质控线C出现肉眼可见条带。2、阳性结果：质控线C和检测线T均出现肉眼可见条带。3、无效结果：未肉眼可见的质控线C4、质量控制：如遇下列情况，请按上述操作步骤使用实验室备用的阳性和阴性样本对该批产品进行质量控制：4.1、新检验员使用本产品。4.2、使用新批号产品。4.3、试剂卡储存温度在2-30℃以外。4.4、测试区温度在2-30℃以外。9意义阳性结果说明检测到登革病毒抗原，结合临床可以诊断为登革病毒感染；阴性结果说明没有检测到登革病毒抗原，但不能排除登革病毒感染。

NS1快速诊断卡的使用

NS1快速诊断卡的使用

NS1快速诊断卡的使用

NS1快速诊断卡的使用

IgM捕捉ELISA法（MacELISA）检测登革热IgM抗体检测步骤1、用稀释液按效价稀释抗人μ链单克隆抗体，100μl/孔，加盖，4℃过夜；2、弃去抗人μ链，用洗涤液重复洗3次，甩干，加封闭液，100μl/孔，置37℃水浴孵育2小时；3、弃封闭液，用洗涤液重复洗3次，甩干。4、将待检血清用稀释液从1：10开始作2或4倍连续稀释，加入酶标板孔中，100μl/孔，同时加入已1：10稀释的阳性血清、阴性血清对照各4孔，100μl/孔，置37℃水浴孵育2小时；5、弃去血清，用洗涤液重复洗3次，甩干，分别加4个型DV抗原及阴性抗原对照，100μl/孔，4℃过夜；6、弃抗原，用洗涤液重复洗3次，甩干，加用稀释液稀释至工作浓度的相应的登革热酶标单克隆抗体，正常抗原加4个型混合的酶标单克隆抗体，100μl/孔，37℃水浴2小时；7、弃去标记物，用洗涤液重复洗3次，甩干，于各反应孔内加A/B液各一滴，37℃，避光3～5分钟；8、加终止液于每反应孔，一滴/孔。

IgM捕捉ELISA法（MacELISA）检测登革热IgM抗体结果判断1、目测方法：阳性对照孔呈明显蓝色，阴性对照孔呈无色，对照成立；若待检血清孔呈明显淡蓝色或深蓝色（TMB），则标本为登革热IgM抗体阳性，反之阴性。2、酶联免疫检测仪检测：于450nm（TMB）阳性对照孔OD值/阴性对照孔OD值，即P/N≥2.1，对照成立；若待检血清孔OD值与阴性对照孔OD比值≥2.