细胞融合与单克隆抗体 (2).ppt

3.肿瘤的导向治疗和放射免疫显像技术将针对某一肿瘤抗原的单克隆抗体与化疗药物或放疗物质连接，利用单克隆抗体的导向作用，将药物或放疗物质携带至靶器官，直接杀伤靶细胞，称为肿瘤导向治疗。另外，将放射性标记物与单克隆抗体连接，注入患者体内可进行放射免疫显像，协助肿瘤的诊断。第117页,共118页，星期六，2024年，5月感谢大家观看第118页,共118页，星期六，2024年，5月通过选择性培养后生长的杂交瘤细胞，仅有部分是分泌预定特异性抗体的杂交瘤细胞。可取上清液，根据抗原的性质、抗体类型及所需灵敏度等具体情况来加以选择。可溶性抗原可采用放射免疫、免疫酶标测定、间接血凝等方法测定。细胞抗原可采用免疫荧光、51Cr释放试验、溶血空斑测定、补体依赖的细胞毒等方法直接测定针对这些抗原的抗体。五.杂交瘤细胞的筛选和克隆化5.1单克隆抗体技术第85页,共118页，星期六，2024年，5月融合后细胞在HAT培养基中存活情况脾细胞（HGPRT+,TK+,不能长期生长）骨髓瘤细胞（HGPRT-,TK-，不能生长）杂交瘤细胞（HGPRT+,TK+，能够生长）5.1单克隆抗体技术第86页,共118页，星期六，2024年，5月细胞融合的选择示意图第87页,共118页，星期六，2024年，5月抗体检测抗原结合法用125I放射性元素标记的抗原第二抗体法-酶联免疫吸附测定法（ELISA）荧光活化细胞分类器法5.1单克隆抗体技术第88页,共118页，星期六，2024年，5月利用培养基对单抗进行鉴定的过程第89页,共118页，星期六，2024年，5月酶联免疫吸附法(ELISA)抗原第1抗体酶第2抗体待检杂交瘤培养上清液底物有色产物酶标仪检测技术原理：5.1单克隆抗体技术第90页,共118页，星期六，2024年，5月单克隆抗体的纯化硫酸铵沉淀法离子交换层析A蛋白-Sepharose亲和层析5.1单克隆抗体技术第91页,共118页，星期六，2024年，5月利用单个细胞培养技术选育出遗传稳定的分泌特异抗体的细胞系。在培养过程中，一般要加能释放某些生长因子促进杂交瘤生长的饲养细胞，如小鼠的腹腔巨噬细胞、脾细胞或胸腺细胞等。方法有有限稀释法、软琼脂培养法、显微操作法、应用荧光激活分选仪等。培养上清中X抗体的检测克隆化培养单克隆杂交瘤细胞培养上清中X抗体的检测杂交瘤细胞可持续分泌单克隆抗体规模化培养获得大量单克隆抗体5.1单克隆抗体技术六、杂交瘤细胞的克隆化培养第92页,共118页，星期六，2024年，5月有限稀释法通过适当的稀释达到分离单个细胞进行培养的目的1）取出阳性孔内的细胞进行计数2）用培液将其稀释到例如每毫升内10个细胞。3）如果在96孔板内每孔加0.1ml，其机率将为每孔内落入一个细胞。4）加入一定数量的饲养细胞，经过8~12天后，可观察到有集落生长的孔。5）根据检测的阳性结果再次进行克隆化。第93页,共118页，星期六，2024年，5月软琼脂培养法在加入饲养细胞的无菌平皿内铺上一层0.5％的琼脂，待凝固后再铺上一层混有杂交瘤细胞的0.25％的软琼脂。待细胞长成集落后，用毛细管吸出移种于含饲养细胞的96孔板内。第94页,共118页，星期六，2024年，5月体内：BALB/c小鼠体内诱发含有单抗的腹水体外：无血清培养基悬浮培养等七、冻存及单克隆的大量生产第95页,共118页，星期六，2024年，5月5.1.3单克隆抗体的规模化生产 杂交瘤细胞直接植入动物体内：1.将106-107的单克隆杂交瘤细胞，由皮下植入同系或组织相容正常的小鼠的体内，约过两周后，在小鼠的皮下形成相应的移植性肿瘤，用这些肿瘤再去接种更多的小鼠。2.在肿瘤出现后的一段时期，通过多次采血得到含单克隆抗体的血清，每ml血清内约含1-10ml的抗体，但取血量有限。3.因此，可将相同数量的单克隆抗体细胞植入在3-10天前经腹腔注射0.5ml异十八烷或其它矿物油的初次致敏的小鼠腹腔内。在接种后的二周左右的时间内，经穿刺而得到5-10ml的腹水，内含单克隆抗体的浓度5-20mg/ml5.1单克隆抗体技术第96页,共118页，星期六，2024年，5月单抗的大规模生产1）诱生腹水将稳定分泌单抗的细胞株，通过扩大培养，接种于Balb/c小鼠腹腔内，使其以腹水瘤形式在小鼠腹腔内增殖，从而得到大量含单抗的腹水。方法是将降植烷或石蜡油注入Balb/c小鼠腹腔，0.5ml/只，7天后腹腔接种3