黄豆芽的蛋白质含量测定 .pdfVIP

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黄豆芽的蛋白质含量测定

(考马斯亮蓝G-250比色法)

一、实验目的

1、了解考马斯亮蓝法测定蛋白质含量的原理,掌握其测定方法。

2、熟练掌握分光光度计的使用技术。

二、实验原理

考马斯亮蓝G-250是一种染料,在游离状态下呈红色,当它与蛋白质结合后变为蓝色,

该结合物在595nm波长下有最大光吸收。在一定的蛋白质浓度范围内(0~1000μg/mL),其吸

光度与蛋白质含量成正比,故可用于可溶性蛋白质的定量测定。

三、仪器、试剂和材料

1、仪器设备

分析天平、10mL塑料离心管、5mL移液管、研钵、量筒、50mL离心管、10mL容量瓶、

离心机、722型分光光度计

2、试剂

(1)标准蛋白质原液:称取100mg牛血清白蛋白,溶于蒸馏水并定容至100mL,即为

1mg/mL的标准蛋白质原液。

(2)考马斯亮蓝G-250试剂:称取100mg考马斯亮蓝G-250,溶于50mL95%乙醇中,加入

85%(m/v)的磷酸100mL,最后用蒸馏水定容到1000mL。此溶液在常温下可放置一个月。

3、材料:黄豆芽

四、操作步骤

(一)黄豆芽蛋白质样品的制备

1、准确称取新鲜黄豆芽下胚轴2g,放入研钵中,加入2mL蒸馏水研成匀浆,转移至50mL离

心管中,再用6mL蒸馏水充分洗涤研钵,洗涤液收集于同一量筒中,定容至10ml,混匀;

2、冰浴中放置10-20min以充分提取;

3、从量筒中取1ml至离心管,12000rpm离心5min,将上清液倒入10mL量筒,以蒸馏水定容

至10mL,即得黄豆芽蛋白质样品溶液。

(二)标准曲线制作

2、高浓度标准曲线的制作(0~1000μg/mL)

取6支1.5mL的离心管,按表1.2加入试剂,配制不同浓度的蛋白质标准液

试管号012345

1mg/mL的标准蛋00.20.40.60.81.0

白质原液(mL)

蒸馏水(mL)1.00.80.60.40.20

蛋白质含量(μg)02004006008001000

OD00.1960.3460.4870.6020.781

595nm

另取6支10mL的离心管,编号标记,从上述各管中分别吸取0.1mL溶液,加入5mL考

马斯亮蓝G-250试剂,盖上离心管盖子,充分混匀,放置3min后在595nm波长下比色测

定(比色应在lh内完成),记录各管测定的光密度值OD595nm。以牛血清白蛋白含量(μg)

为横坐标,以吸光度为纵坐标,制作蛋白质浓度为0~1000μg/mL的标准曲线如下:

高浓度标准曲线

y=0.0008x

0.9

0.80.781

0.7

m0.60.602

n

5

90.50.487吸光度

5

0.4线性(吸光度)

光0.30.346

0.20.196

0.1

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