猪塞尼卡谷病毒的检测　重组酶恒温扩增法.docx

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猪塞尼卡谷病毒的检测重组酶恒温扩增法

范围

本文件描述了猪塞尼卡谷病毒（SenecaValleyvirus，SVV）的重组酶恒温核酸扩增检测（RecombinasePolymeraseAmplification）方法。

本文件适用于猪塞尼卡谷病毒的快速检测、诊断、检疫、监测和流行病学调查。

规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB19489实验室生物安全通用要求

NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范

术语和定义

本文件没有需要界定的术语和定义。

试剂或材料

除非另有规定，仅使用分析纯试剂。所用液体试剂均需使用无DNA/RNase的容器进行分装。

RNA提取试剂盒：市售。

重组酶恒温扩增试剂盒：市售。

水：GB/T6682，一级。

PBS溶液：pH值7.4。

称取磷酸二氢钾（KH2PO4）0.27?g、磷酸氢二钠（Na2HPO4）?1.42?g、氯化钠（NaCl）8?g、氯化钾（KCl）0.2?g，加灭菌水约800?mL充分搅拌溶解，加入浓盐酸调pH值至7.4，定容至1?000?mL。

0.1%DEPC水。

1?000?mL水中加1?mLDEPC，放在1?000?mL容量瓶中静置4?h后备用。

重组酶恒温扩增检测引物：按附录A规定。

阳性、阴性对照。

阳性对照：带有SVV序列DNA全长的质粒。

阴性对照：已知SVV阴性样本的DNA。

仪器设备

荧光定量PCR仪：配有配套反应管（板）。支持多通道检测。

分析天平：精度为1?mg。

高速冷冻离心机：转速不低于13?000?g/min。

冰箱：2?℃～8?℃和-20?℃以下。

酸度计。

电热恒温水槽：室温至100?℃。温度精度±0.5?℃。

涡旋振荡器。

微量移液器：10?μL、20?μL、100?μL、1?000?μL。

离心管：1.5?mL。无DNase和RNase。

试验步骤

样品

符合GB19489和NY/T541中关于实验室生物安全和兽医诊断样品的采集和保存的要求。

样品采集

棉拭子样品

无菌采集猪口鼻棉拭子。

组织样品

按照NY/T541兽医诊断样品采集、在运抵检测地点前的样品保存与运输技术规范确定的规程，无菌采集病死猪的淋巴结、脾、胸腺、肠粘膜和肺等组织样品。

样品的保存

2?℃～8?℃不超过24?h，-20?℃以下不超过3个月，-70?℃以下不超过10年。

样品处理

棉拭子样品处理方法

口鼻拭子管6?000?g/min震荡45?s，取200?μL进行RNA提取。

淋巴结、脾、胸腺等组织样品处理

取0.05?g（±0.01?g）组织块放入盛有500?μLPBS缓冲液的研磨管中，6?000?g/min震荡研磨45?s，制成约10%的组织匀浆液，5?000?g/min离心5?min，取200?μL上清液进行RNA提取。

RNA的提取

按RNA提取试剂盒说明书提取样品和对照组的RNA。提取的RNA应立即检测，否则应置于-70?℃冻存。

重组酶恒温核酸扩增

扩增试剂准备

设50?μL重组酶恒温核酸扩增反应体系，扩增反应液体系见表1。按重组酶恒温扩增试剂盒说明书配制体系并完成相关操作。

扩增反应液体系

组分

用量

μL

1%DEPC水

25.4

10?μMSVV-F

2

10?μMSVV-R

2

10?μMSVV-Probe

0.6

模板

5

恒温扩增试剂

15

恒温扩增反应

选择检测模式：FAM。将加样后的PCR管放入荧光PCR检测仪内，做好标记。恒温扩增反应条件按照表2设置。

恒温扩增反应条件

反应温度

39?℃

循环数

40

信号采集

每30?s

反应时间

20?min

结果判定

阴性、阳性结果判定

结果判定见表3。

结果判定

序号

通道

Ct值

结果判断

1

FAM

UNDET或40

样本低于检测限，报告为阴性

2

FAM

≤37

判定为阳性

3

FAM

37～40

复检一次，如仍为37～40，则判定为阴性

质控标准

阴性对照无Ct值或大于37，并且无扩增曲线。

阳性对照的Ct值应小于等于37，并出现典型的扩增曲线。

如阴性和阳性对照不满足以上条件，此次实验视为无效。

结果参考图谱见附录B。

（规范性）

重组酶恒温核酸扩增引物

重组酶恒温核酸扩增引物见表A.1。

重组酶恒温核酸扩增引物

引物

序列

SVV-F

5’-TTCTAAAGCGCAAATTCGTCCAAAACAACGACG-3’

SVV-R

5’-CCAGAATGTTGAGCCAACATAGAAA